Analyse phytochimique et potentiel anti-inflammatoire de l’extrait hexanique de rhizome d’Acanthus mollis L.
Référence : Pharmaceuticals 2023. — PMC9966330 / PMID 37259310 · DOI 10.3390/ph16020159 Type : etude in vitro · Plante : Acanthe a feuilles molles · Propriété → Anti-inflammatoire Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Les rhizomes d’Acanthus mollis ont traditionnellement été utilisés pour le traitement de plusieurs affections impliquant une inflammation. Cependant, à notre connaissance, leur composition chimique et leurs propriétés pharmacologiques n’ont pas été étudiées jusqu’à présent. Comme première approche, cette étude analyse la phytochimie de l’extrait hexanique de rhizome d’A. mollis et ses capacités anti-inflammatoires et antioxydantes dans des essais de culture cellulaire HepG2 et RAW 264.7. Le profilage chimique a été réalisé par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse sans modification des molécules natives. Les phytostérols libres (tels que le β-sitostérol) représentent 70 % des composés détectés. La capacité anti-inflammatoire de l’extrait de rhizome d’A. mollis est médiée par la diminution de la production de NO dans les cellules RAW 264.7 préalablement stimulées par le lipopolysaccharide, de manière dose-dépendante. En outre, le prétraitement des cellules HepG2 par l’extrait de rhizome prévient les dommages causés par le stress oxydant, à la fois par le piégeage des ROS et par le système enzymatique antioxydant cellulaire. À cet égard, l’extrait a réduit l’activité de la glutathion peroxydase et de la glutathion réductase, qui étaient stimulées dans des conditions de stress oxydant. Nos résultats suggèrent que l’extrait des rhizomes d’A. mollis pourrait constituer une source potentielle de produits naturels à activité anti-inflammatoire et pourrait valider l’utilisation traditionnelle d’A. mollis.
1. Introduction
L’inflammation est un mécanisme de défense en réponse à des stimuli nocifs, tels que les agents pathogènes, et à des lésions tissulaires. Elle est impliquée dans de nombreuses pathologies, telles que les allergies, l’asthme et l’hépatite, et dans des maladies auto-immunes, telles que la maladie cœliaque et la polyarthrite rhumatoïde. Elle est également liée, sous sa forme chronique, au diabète, à l’arthrose, aux maladies cardiovasculaires, à l’obésité et au cancer. L’inflammation avec laquelle ces pathologies surviennent est associée à un excès de radicaux libres, qui provoque des dommages oxydatifs et joue un rôle crucial dans le développement et le maintien de ce processus. En outre, l’inflammation réduit la capacité antioxydante cellulaire. Par conséquent, les deux processus que sont l’inflammation et le stress oxydant sont étroitement liés. L’arsenal disponible de médicaments anti-inflammatoires comprend les anti-inflammatoires non stéroïdiens, les corticostéroïdes et les médicaments immunosuppresseurs. Cependant, il existe un intérêt croissant pour la recherche de nouveaux remèdes anti-inflammatoires, compte tenu du manque d’efficacité dans certains cas et des effets secondaires des traitements actuels. Le nombre de nouveaux composés anti-inflammatoires dérivés des plantes augmente continuellement. Des polyphénols, tels que la quercétine, l’épigallocatéchine-3-gallate, la curcumine et le resvératrol, et des alcaloïdes tels que la colchicine et la capsaïcine ont montré cette aptitude pharmacologique dans des études cliniques. D’autre part, parmi les substances obtenues à partir de plantes, les phytostérols méritent également d’être mentionnés. Des molécules telles que le sitostérol, le stigmastérol et le campestérol ont un effet hypolipidémiant connu en diminuant l’absorption du cholestérol, mais il a également été montré qu’elles possèdent des propriétés anti-inflammatoires. Par conséquent, le β-sitostérol peut être utilisé dans des pathologies telles que l’hyperplasie bénigne de la prostate, les cancers du côlon et du sein, l’athérosclérose et les ulcères gastro-intestinaux.
Les Acanthaceae sont considérées comme l’une des principales familles des plantes à fleurs dicotylédones. Cette famille comprend 242 genres et 3947 espèces, principalement répartis dans les zones tropicales et subtropicales, surtout en Amérique du Sud et centrale, en Afrique, en Asie du Sud et en Australasie. Cependant, certaines espèces se trouvent également dans les zones tempérées du bassin méditerranéen. Le genre Acanthus, avec 32 espèces, comprend des herbes vivaces et rarement de petits sous-arbrisseaux. Elles présentent des feuilles basales et des fleurs en épis terminaux avec des bractées épineuses. Cette dernière caractéristique donne son nom au genre, qui dérive du mot grec signifiant épineux. Comme cela se produit dans d’autres genres botaniques, certaines espèces d’Acanthus ont été utilisées en médecine traditionnelle. Parmi celles-ci, la seule espèce native d’Europe est Acanthus mollis L. Cette plante est tenue en haute estime depuis l’Antiquité, où elle était utilisée par les architectes et les artistes dans des motifs ornementaux, comme le montre son incorporation en tant qu’élément décoratif caractéristique dans les colonnes corinthiennes. Cette plante herbacée à rhizomes présente des feuilles basales luisantes, vert foncé, profondément découpées, et ses fleurs s’épanouissent de la fin du printemps au milieu de l’été. Chaque fleur est sous-tendue par une bractée épineuse. Les fleurs possèdent un grand lobe calicinal supérieur pourpre à vert et des pétales blancs soudés. Communément nommée bear’s breeches, cette plante a traditionnellement été utilisée pour le traitement de plusieurs affections. En Sicile, les parties aériennes sont indiquées dans le traitement du psoriasis. De plus, en Italie, en Grèce, en Espagne et à Madère, ses feuilles sont employées comme vulnéraire pour les maladies cutanées, les brûlures et les plaies. Ses feuilles sont employées dans le traitement de l’inflammation des muqueuses des voies respiratoires et digestives, des troubles intestinaux, de la diarrhée, de la colite, de l’hémoptysie, des maux de dents et de la stomatite. Ses feuilles sont employées contre les céphalées, les convulsions, la nervosité, les rhumatismes, les contusions et les jambes et pieds enflés. Elles sont également utilisées comme diurétique et analgésique pour les voies urinaires. À ce jour, plusieurs études ont été menées pour analyser les propriétés pharmacologiques et la composition phytochimique des parties aériennes de cette plante. La capacité anti-inflammatoire et antihémorroïdaire de ses feuilles ainsi que leurs aptitudes antifongiques et antioxydantes ont été rapportées. En outre, la présence de phénylpropanoïdes, de benzoxazinoïdes, de flavonoïdes et de verbascoside a été identifiée. Ce dernier composé, isolé des feuilles d’A. mollis, a démontré une activité neuroprotectrice. Bien que les feuilles de cette plante aient été étudiées à la fois en termes de composition chimique et au regard de leurs propriétés pharmacologiques, à notre connaissance, ses rhizomes n’ont pas été étudiés jusqu’à présent. L’objectif de la présente étude était d’analyser la phytochimie de l’extrait hexanique de rhizome d’A. mollis et sa capacité anti-inflammatoire et antioxydante dans des essais de culture cellulaire.
2. Résultats
2.1. Profilage chimique de l’extrait hexanique d’A. mollis
L’extrait hexanique a été caractérisé par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) sans modification des molécules natives (Figure 1).
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Cette analyse a permis l’identification de seize composés connus (Tableau 1) de différentes classes chimiques et a fourni un aperçu complet du contenu chimique principal de l’extrait hexanique. La majorité des composés détectés étaient des phytostérols libres et représentaient 70 % de l’aire moyenne du chromatogramme ionique total (TIC). Parmi ces phytostérols, le β-sitostérol s’est révélé être le stérol le plus abondant (35,4 %). Les acides gras représentaient 21 %, et les parties restantes appartenaient à des caractéristiques non identifiées et à d’autres classes chimiques. Une faible quantité (0,2 %) a été annotée comme esters de phytostérols (Figure 2).
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2.2. Cytotoxicité de l’extrait et du β-sitostérol
Aucune cytotoxicité significative n’a été détectée dans les macrophages ni dans les lignées cellulaires d’hépatocarcinome à des concentrations allant jusqu’à 100 µg/mL d’extrait hexanique de rhizome d’A. mollis ou de β-sitostérol.
2.3. Inhibition de la production d’oxyde nitrique par les macrophages
Afin d’analyser la capacité anti-inflammatoire de l’extrait de rhizome d’Acanthus, une modification de la production de NO dans une culture cellulaire RAW 264.7 après stimulation par le LPS a été déterminée. Les résultats sont présentés dans la Figure 3 sous forme de pourcentage de production de NO par rapport au contrôle positif (cellules stimulées par le LPS et traitées par PBS). Le β-sitostérol a été utilisé comme composé de référence.
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Une diminution dose-dépendante de la production de NO a été observée dans les cellules traitées avec l’extrait de rhizome. Aux mêmes concentrations, le β-sitostérol n’a montré aucun effet, tandis que les extraits d’Acanthus, même à faibles doses, ont induit une réduction significative de la production de NO. Comme on peut l’observer, la diminution du NO à la concentration de rhizome la plus élevée (100 μg/mL) a atteint des niveaux proches de 60 % par rapport à la production des cellules témoins induites par le LPS.
2.4. Mesure des espèces réactives de l’oxygène intracellulaires
L’essai a été réalisé dans une culture cellulaire HepG2 se développant à la fois dans des conditions normales de culture et également après induction d’un stress oxydant par le peroxyde d’hydrogène. La lignée cellulaire HepG2 d’hépatocarcinome humain, qui reproduit les hépatocytes, a été retenue comme modèle largement utilisé pour évaluer in vitro les effets de différents composés d’origine naturelle.
Le pourcentage de ROS lié au contrôle après 90 min de traitement dans des cellules se développant dans des conditions normales de culture est présenté dans la Figure 4.
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Les concentrations les plus élevées d’extrait de rhizome testées ont produit une augmentation significative de la fluorescence, et donc des niveaux de ROS intracellulaires, tandis qu’aucun effet n’a été détecté dans les cellules sous traitement par β-sitostérol.
En outre, l’évaluation visant à déterminer si le prétraitement par l’extrait hexanique ou par le β-sitostérol limitait la production de ROS dans des conditions de stress oxydant induit a également été analysée dans une culture cellulaire HepG2. Les résultats sont présentés dans la Figure 5.
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On peut observer que le prétraitement avec les quatre concentrations les plus élevées d’extrait de rhizome a significativement réduit la production de ROS de manière dose-dépendante. D’autre part, le β-sitostérol, seulement à la concentration la plus élevée, a pu réduire les niveaux de ROS, quoique de manière non significative. Ce composé n’a pas eu la capacité, aux concentrations testées, de diminuer la concentration de ROS à l’intérieur de la cellule dans des conditions de stress oxydant.
2.5. Essai enzymatique antioxydant
Une évaluation a été réalisée pour analyser l’effet de l’extrait de rhizome d’Acanthus et du β-sitostérol sur l’activité du système enzymatique antioxydant cellulaire : glutathion peroxydase (GPx) et glutathion réductase (GR). Comme dans l’essai précédent, les cellules se développant dans des conditions normales et dans des conditions de stress oxydant induit ont toutes deux été analysées. Les effets du phytoextrait et du composé de référence sur l’activité de la GPx sont présentés dans la Figure 6. Concernant les cellules se développant dans des conditions normales, aucun effet n’a été détecté entre le traitement des cellules témoins et les rhizomes ou le β-sitostérol. Avec les extraits d’Acanthus, l’activité de la GPx a diminué de manière dose-dépendante, bien que non significative, tandis qu’aucun effet n’a été observé lorsque les cellules étaient traitées par le β-sitostérol. Dans des conditions de stress oxydant induit, les deux traitements ont pu inverser l’effet du stress oxydant et rétablir les niveaux de base de l’activité de cette enzyme.
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La glutathion réductase (GR) est également une enzyme clé au sein du système antioxydant endogène. Dans la présente étude, l’activité de la GR a varié selon une tendance moins claire que la variation observée pour l’activité de la GPx. Comme on peut l’observer dans la Figure 7, l’extrait de rhizome n’a pas affecté l’activité de la GR dans les cellules en conditions normales. Tandis que, dans des conditions de stress, comme dans le cas précédent, il a rétabli les niveaux du contrôle non stressé aux doses plus élevées. Le traitement par β-sitostérol a donné des résultats clairement différents. Concernant les conditions normales de croissance, les doses plus élevées de 60 et 100 μg/mL de ce composé ont pu augmenter significativement l’activité de la GR. Cependant, le prétraitement des cellules avec toutes les concentrations testées est resté incapable de réduire cette activité à des niveaux normaux, bien que la dose de 100 µg/mL ait pu réduire l’augmentation causée par le stress oxydant.
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3. Discussion
L’objectif de la présente étude était d’évaluer la composition phytochimique et l’activité anti-inflammatoire d’un extrait hexanique obtenu à partir de rhizomes d’A. mollis dans un bain à ultrasons à 50 °C pendant 1 h. Ces rhizomes constituent une matière première abondante, car cette plante est couramment utilisée à des fins ornementales en Europe et s’est révélée être une espèce invasive capable de se propager agressivement dans des conditions optimales.
La GC-MS sans modification des molécules natives a conduit à l’identification de seize composés connus, principalement lipophiles (Tableau 1). La présence de phytostérols libres, et plus spécifiquement celle du β-sitostérol, doit être soulignée (Figure 2). Cependant, d’autres composés, tels que les esters de phytostérols, peuvent présenter un grand intérêt compte tenu de leur biodisponibilité différente par rapport aux formes libres.
L’oxyde nitrique (NO) régule les processus de communication neuronale, de vasodilatation et de neurotoxicité. Cependant, il est également un médiateur pro-inflammatoire et sa surproduction induit des lésions tissulaires associées à ce processus. L’oxyde nitrique est produit par les macrophages, et le contrôle de sa production est essentiel pour réduire l’inflammation. Les macrophages sont activés par les lipopolysaccharides (LPS), composants de la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif, qui induisent la production de médiateurs pro-inflammatoires tels que le NO et les prostaglandines, de cytokines pro-inflammatoires telles que IL-6, IL-1β et TNF-α, et d’enzymes telles que l’oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) et la cyclooxygénase-2 (COX-2).
La Figure 3 montre l’effet du β-sitostérol et des extraits hexaniques d’Acanthus sur la production de NO dans une culture cellulaire RAW 264.7 stimulée par le LPS. Aucun effet n’a été détecté après le traitement par le composé de référence. Le β-sitostérol a démontré une puissante activité anti-inflammatoire in vivo dans des études sur l’inflammation aiguë spécifique (réaction immunitaire) et non spécifique réalisées chez des rongeurs. Plus précisément, le β-sitostérol contrôle la production de médiateurs inflammatoires en agissant par inhibition des voies ERK, p38 et NF-κB. Les LPS employés pour stimuler les macrophages sont capables d’activer les récepteurs TLR4. Ces récepteurs activent des kinases, dont l’activité entraîne la libération de dimères NF-κB p50/p65 dans le cytoplasme. Une fois NF-κB transloqué dans le noyau, il se lie à l’ADN et régule l’expression de cytokines inflammatoires telles que IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-12 et INF-β. Le β-sitostérol inhibe l’activation de NF-κB en diminuant l’expression de TLR4, et par conséquent également celle des cytokines mentionnées ci-dessus. La capacité anti-inflammatoire du β-sitostérol est dose-dépendante et similaire à celle obtenue par l’ibuprofène et même par la prednisone. De même, sa capacité à réduire l’œdème et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, telles que TNF-α, a été prouvée dans des études animales en augmentant, en revanche, la production de cytokines anti-inflammatoires. IL-10 est une cytokine anti-inflammatoire qui agit comme facteur régulateur susceptible de supprimer les cascades TNF-α, IL-1β et IL-8. Liu et al. ont suggéré le rôle central d’IL-10 dans la réponse anti-inflammatoire induite par le β-sitostérol. Le β-sitostérol peut induire une augmentation de ces niveaux de cytokines dans des essais in vitro et in vivo. Nos résultats suggèrent que le mécanisme d’action anti-inflammatoire du β-sitostérol n’était pas impliqué dans la réduction des niveaux de NO. Boukes et van de Venter ont observé des résultats similaires dans la culture de la lignée cellulaire U937 de leucémie promonocytaire humaine. Cependant, l’extrait de rhizome d’A. mollis a offert des résultats prometteurs à cet égard, puisqu’il a pu réduire la production de NO de manière dose-dépendante. Afin de confirmer la capacité anti-inflammatoire de l’extrait, son effet sur les niveaux de cytokines pro-inflammatoires devrait être analysé dans de futures études.
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des signaux moléculaires impliqués dans les processus physiologiques normaux. Cependant, en excès, elles provoquent des effets cytotoxiques, qui ont été largement documentés. Par conséquent, puisque le stress oxydant cellulaire est directement lié à l’inflammation, l’effet de l’extrait d’A. mollis et du β-sitostérol sur les niveaux de ROS intracellulaires a été analysé. À cet égard, le traitement des cellules HepG2 par le β-sitostérol n’a montré aucun effet, tandis que les concentrations les plus élevées d’extrait de rhizome testées ont produit une augmentation significative des niveaux de ROS intracellulaires (Figure 4). Boukes et van de Venter ont également observé une augmentation des niveaux de ROS intracellulaires dans des monocytes et monocytes-d/macrophages U937 traités avec un extrait d’Hypoxis spp. riche en phytostérols. Les auteurs ont relié ces résultats à une réponse pro-inflammatoire. Cependant, l’augmentation produite par l’extrait d’Hypoxis a atteint jusqu’à 500 %, tandis que dans cette étude, l’augmentation n’a atteint que 153,2 %. Il convient de garder à l’esprit que, en pratique, un effet pro-oxydant modéré peut augmenter les défenses antioxydantes de la cellule, ce qui conduirait à une plus grande protection contre le stress oxydant. Afin de déterminer si l’augmentation observée des niveaux de ROS pouvait être considérée comme légère ou modérée et donc positive pour la cellule, nous avons analysé l’effet de l’extrait dans des cellules se développant sous stress oxydant induit. Dans ces conditions, le prétraitement par l’extrait hexanique a réduit significativement le stress oxydant intracellulaire ; cet effet était plus marqué lorsque des concentrations plus élevées étaient utilisées (Figure 5). De plus, seules les concentrations les plus élevées de β-sitostérol testées ont montré des effets antioxydants dans cet essai. Nos résultats étaient cohérents avec ceux obtenus par Boukes et van de Venter, qui n’ont trouvé aucun effet du β-sitostérol sur les niveaux de ROS dans des cellules U937 de leucémie promonocytaire humaine. D’autre part, Moreno a rapporté une réduction des niveaux d’anion superoxyde (O2−) et de H2O2 dans la lignée cellulaire RAW 264.7 stimulée par PMA (phorbol-12-myristate-13-acétate) après traitement par le β-sitostérol à des concentrations équivalentes à celles utilisées dans cette étude. L’auteur a conclu que cette aptitude du β-sitostérol n’était pas due à sa capacité à capter les radicaux libres, mais plutôt à sa capacité à agir sur le système antioxydant intracellulaire ; ainsi, ses résultats à cet égard concordaient avec ceux obtenus dans cette étude.
L’effet plus important de l’extrait par rapport à la substance de référence (Figure 5) pourrait être dû soit à un effet synergique de ses composants, soit à la présence d’esters de phytostérols. Dans la lignée cellulaire d’adénocarcinome du côlon humain HT-29, le férulate de β-sitostérol a démontré la capacité de réduire les niveaux de ROS intracellulaires de manière similaire à l’α-tocophérol et à la N-acétylcystéine. Les esters de phytostérols semblent présenter une biodisponibilité plus élevée, ce qui améliore leur bioactivité.
La production incontrôlée de ROS qui se produit pendant le stress oxydant contribue à la pathogenèse des maladies cardiovasculaires, du cancer et de l’inflammation. Des niveaux élevés de ROS sont impliqués dans l’activation de la voie de signalisation de l’acide arachidonique ; par conséquent, l’extrait hexanique des rhizomes d’A. mollis pourrait montrer un effet anti-inflammatoire par ce mécanisme d’action antioxydant.
L’activité GPx catalyse la réduction des radicaux peroxydes en alcools et oxygène, et de H2O2 en eau et oxygène, limitant ainsi son effet nocif sur les cellules. Par conséquent, l’activité de cette enzyme joue un rôle fondamental dans la protection contre le stress oxydant.
La présence de H2O2 a induit une augmentation significative de l’activité enzymatique GPx, indiquant ainsi une réponse claire du système antioxydant de la cellule au stress oxydant, comme on peut le déduire en comparant les deux contrôles (C des cellules non stressées, en bleu ; et C+ des cellules stressées, en rouge) (Figure 5). L’extrait comme le β-sitostérol ont pu inverser l’effet du stress oxydant après traitement par H2O2. Au vu de ces résultats, la présence de phytostérols dans l’extrait hexanique des rhizomes pourrait expliquer cette activité, capable de rétablir les niveaux de base de l’activité de cette enzyme.
Ces enzymes GPx et GR sont des mécanismes vitaux de la défense cellulaire contre les dommages oxydatifs. Les changements de l’activité de ces enzymes antioxydantes peuvent être considérés comme des biomarqueurs de la réponse antioxydante. La glutathion peroxydase catalyse l’oxydation du GSH en glutathion oxydé aux dépens de H2O2 ou d’autres peroxydes, et la GR recycle le glutathion oxydé en GSH. Pour cette raison, on peut observer comment l’induction d’un stress oxydant dans les cellules HepG2 par H2O2 conduit à l’augmentation de l’activité de ces enzymes afin de réduire les niveaux d’espèces réactives en leur sein. Cependant, un retour rapide aux valeurs de base de l’activité de ces protéines une fois le stress surmonté place la cellule dans une condition favorable pour faire face à une nouvelle agression. Par conséquent, la capacité à réduire les niveaux de l’activité de GPx de l’extrait comme du β-sitostérol à toutes les concentrations testées dans les conditions de stress oxydant leur a conféré un effet protecteur notable contre ce type d’altération. Au vu des résultats, on peut conclure que certains composés bioactifs présents dans l’extrait, tels que le β-sitostérol, n’ont pas altéré l’état basal de la cellule, mais l’ont protégée par le système antioxydant endogène dans des situations de stress oxydant ou inflammatoire, comme l’ont rapporté d’autres auteurs pour des extraits de yerba maté et de café vert.
4. Matériels et méthodes
4.1. Procédures expérimentales
Tous les produits chimiques étaient de qualité réactif analytique et ont été achetés auprès de Sigma (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne). La glutathion réductase issue de la levure de boulanger (S. cerevisiae) a été achetée auprès de Sigma-Aldrich (Madrid, Espagne). Les protéines ont été quantifiées à l’aide d’un kit de dosage protéique BCA de Thermo Scientific (Gul Cir, Singapour). La fluorescence a été mesurée dans un lecteur de plaques Fluostar optima (BMG Labtech, Offenburg, Allemagne), à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et d’émission de 529 nm.
4.2. Matériel végétal et préparation de l’extrait
Les rhizomes d’Acanthus mollis ont été collectés au stade végétatif de la plante en septembre 2017 à La Isla, Colunga (Asturies, Espagne) (43°48′39,5″ N–5°22′48,13″ W). Toutes les plantes échantillonnées avaient plus de 10 ans. Le matériel végétal a été identifié et authentifié par le département botanique de l’Université San Pablo-CEU à Madrid. Un spécimen témoin (réf. 3372) a été déposé dans l’herbier de la Faculté de pharmacie, Université San Pablo-CEU à Madrid. Le développement majeur des feuilles et des rhizomes, associé à la longue photopériode et à la forte intensité lumineuse, faisait de septembre une période appropriée pour la collecte des rhizomes. Les rhizomes ont été séchés à température ambiante (20–25 °C), puis répartis uniformément et retournés toutes les 24 h. Lorsque l’humidité a été réduite à des valeurs inférieures à 10–12 %, les rhizomes ont été broyés en poudre à l’aide d’un broyeur Culatti équipé d’un filtre à mailles de 1 mm (Janke and Kunkel GMGH, Staufen, Allemagne). Le matériau broyé a été extrait trois fois avec de l’hexane dans un bain à ultrasons (Ultrasons, Selecta®, Barcelone, Espagne) à 50 °C pendant 1 h avec un rapport solvant/solide de 10mL/g. L’hexane a été choisi comme solvant en raison de ses attributs, tels qu’une récupération simple, une nature apolaire et une faible chaleur latente de vaporisation. Cela a permis l’extraction de molécules apolaires de grand intérêt pharmacologique. L’extrait a été filtré à travers du papier filtre Whatman no. 1 puis évaporé à sec sous pression réduite à <50 °C à l’aide d’un évaporateur rotatif Buchi. L’extrait concentré a ensuite été séché jusqu’à poids constant sous un flux d’air froid à température ambiante (22 °C) et conservé à 4 °C jusqu’à utilisation. Le rendement de l’extrait était de 0,37 % (w/w).
4.3. Culture cellulaire
Les lignées cellulaires HepG2 d’hépatocarcinome humain et RAW 264.7 de macrophages murins ont été obtenues auprès de l’European Collection of Cell Cultures (Health Protection Agency, Londres, Royaume-Uni) (réf. ECACC 85011430 et réf. 91062702, respectivement).
Dans les deux cas, les cellules ont été cultivées dans de l’EMEM (Eagle’s Minimum Essential Medium) supplémenté avec 2 mM de glutamine, 1 % d’acides aminés non essentiels, 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % d’antibiotiques (10 mg/mL de streptomycine et 10 000 U de pénicilline). Elles ont été maintenues dans un incubateur à 37 °C dans une atmosphère de 5 % de CO2 dans l’air. L’état de la culture a été régulièrement vérifié toutes les 24 h par observation au microscope.
4.4. Analyse GC-MS
Une analyse de l’extrait hexanique a été réalisée au moyen d’un chromatographe en phase gazeuse Thermo Trace 1300 équipé et couplé à un détecteur de masse, spectromètre Thermo TSQ 8000, avec une colonne capillaire ZB-5ms (30 m × 0,25 mm, 0,25 μm). L’extrait hexanique a été dissous dans du n-hexane et injecté directement en GC-MS. Les échantillons ont été injectés à 310 °C en mode split (rapport de split 25:1) avec un volume de 1,0 μL. L’hélium a été utilisé comme gaz vecteur à un débit constant de 1 mL/min. Le programme de température de la GC a été initié à 200 °C et maintenu pendant 0,5 min, augmenté jusqu’à 310 °C à 30 °C/min et maintenu pendant 10 min. Une source d’ionisation par impact électronique (EI) a été appliquée, l’énergie des électrons était de 70 eV, la température de la source a été fixée à 280 °C et la température de l’interface à 310 °C. Les composés ont été déterminés au moyen de composés standards, de spectres de masse dans une base de données (NIST 12.0) (National Institute of Standards and Technology) et des données chromatographiques (indices de rétention) rapportées dans la littérature.
4.5. Essai de cytotoxicité
L’effet cytotoxique de l’extrait a été évalué par un essai MTT. Les cellules ont été exposées à diverses concentrations d’extrait et de β-sitostérol pendant 24 h (20, 40, 60, 80 et 100 μg/mL dilués dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)). Les concentrations testées étaient des dilutions en série d’une solution mère dans le DMSO avec du PBS. Les concentrations finales de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans les essais cellulaires sont restées inférieures à 0,1 %. Ces concentrations de DMSO n’ont pas affecté la viabilité cellulaire. La solution saline tamponnée au phosphate a été utilisée comme contrôle négatif et la doxorubicine comme contrôle positif. Les tests ont été réalisés en triplicat.
4.6. Production de nitrite dans RAW 264.7 avec le réactif de Griess
Afin de déterminer l’activité anti-inflammatoire de l’extrait hexanique de rhizome, l’inhibition de la production d’oxyde nitrique a été évaluée dans des cellules RAW 264.7 (lignée cellulaire de macrophages murins) qui avaient été préalablement stimulées par des LPS. Cet essai est fondé sur la réaction de Griess. Les cellules ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits (6 × 10^5 cellules par puits). La plaque a été maintenue dans un incubateur à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 pendant 24 h. Les cellules ont ensuite été traitées soit avec un milieu de culture (contrôle négatif), soit avec 1 μg/mL de LPS, en l’absence (contrôle positif) ou en présence de diverses concentrations d’extrait d’Acanthus ou de β-sitostérol (20, 40, 60, 80 et 100 μg/mL) pendant 24 h. Par la suite, 100 μL de milieu de culture ont été prélevés dans chaque puits et 90 μL de sulfanilamide à 1 % dans de l’acide phosphorique à 5 % dans H2O ont été ajoutés. Après 5 min à température ambiante, à l’abri de la lumière, 90 μL de N-(1-naphtyl)-éthylènediamine à 0,1 % ont été ajoutés. La plaque a été incubée dans l’obscurité pendant 30 min, après quoi l’absorbance a été mesurée à 550 nm dans un lecteur de plaques (Spectrostar Nano BMG Labtech, Ortenberg, Allemagne). Tous les tests ont été réalisés en triplicat.
4.7. Essai des ROS intracellulaires
Afin d’étudier l’effet de l’extrait hexanique de rhizome d’A. mollis contre la production de ROS dans une culture cellulaire HepG2, deux conditions de croissance ont été évaluées : des cellules traitées avec l’extrait dans des conditions normales de culture, et une préincubation avec l’extrait avant l’induction d’un stress oxydant par 200 mM H2O2. À cette fin, 15 000 cellules ont été ensemencées dans chaque puits d’une plaque de 96 puits dans 200 µL d’EMEM supplémenté avec 2 mM de glutamine, 1 % d’acides aminés non essentiels, 1 % de FBS et 1 % d’antibiotiques. Pour réaliser cet essai, le pourcentage de sérum dans le milieu a été réduit afin d’empêcher toute interaction entre les composés présents dans l’extrait et certains composants du sérum qui pourraient autrement déclencher des artéfacts avec activité cytotoxique.
Pour l’essai dans des conditions normales de culture, après 24 h d’incubation, le milieu a été remplacé par diverses concentrations de l’extrait ou de β-sitostérol dissoutes dans le milieu de culture correspondant supplémenté avec 1 % de FBS. Les plaques ont été incubées pendant 24 h supplémentaires à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2. Un essai au diacétate de 2-7-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA) a ensuite été réalisé sur la lignée cellulaire HepG2 afin de déterminer les niveaux de ROS intracellulaires. La mesure de la fluorescence a commencé lorsque l’extrait ou le composé de référence a été ajouté, toutes les 15 min jusqu’à un maximum de 90 min. La fluorescence a été mesurée à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et d’émission de 529 nm. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de fluorescence par rapport au contrôle.
Pour l’étude en conditions de stress oxydant, après 24 h d’incubation, le milieu a été remplacé par diverses concentrations de l’extrait ou de β-sitostérol dissoutes dans le milieu de culture correspondant supplémenté avec 1 % de FBS. Après 24 h, le milieu a été remplacé par 0,02 mM de DCFH-DA pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS, et le stress oxydant a été induit par 200 mM de peroxyde d’hydrogène. La mesure de la fluorescence a commencé lorsque H2O2 a été ajouté, toutes les 15 min jusqu’à un maximum de 90 min. Tous les tests ont été réalisés en triplicat.
4.8. Mesure de l’activité enzymatique antioxydante
L’effet de l’extrait hexanique de rhizome d’Acanthus ou du β-sitostérol sur l’activité de la GPx et de la GR dans la lignée cellulaire HepG2 a été évalué. Comme dans l’essai précédent, cet effet a été évalué à la fois dans des conditions normales de culture et dans des conditions de stress oxydant.
Dans des boîtes de Petri de 100 × 20 mm avec 7 mL de milieu de culture, 6 × 10^6 cellules ont été ensemencées. Après 24 h d’incubation, le milieu a été remplacé par diverses concentrations d’extrait de rhizome d’Acanthus ou de β-sitostérol dissoutes dans un milieu de culture supplémenté avec 1 % de FBS.
Pour l’essai dans des conditions normales de culture, après 24 h de prétraitement, les cellules ont été collectées avec un grattoir et lysées. Pour l’étude des cellules en stress oxydant, après 24 h de prétraitement, le milieu a été remplacé par 7 mL de milieu dans le cas du contrôle ou par un milieu avec 200 mM H2O2, et les cellules ont été incubées pendant 3 h. Les cellules ont ensuite été collectées et lysées.
La mesure de l’activité GPx était fondée sur l’oxydation du GSH médiée par l’enzyme couplée à la disparition du NADPH en tant que cofacteur de la GR selon le protocole de León-González et al. L’activité GR a été déterminée par la diminution de l’absorbance qui se produisait en raison de l’oxydation du NADPH. Tous les tests ont été réalisés en triplicat.
4.9. Analyse statistique
Une analyse statistique des données a été réalisée par ANOVA à un facteur après avoir vérifié l’homogénéité des variances au moyen du test de Levene dans le programme IBM SPSS Statistics 24. Les comparaisons post hoc ont été effectuées en employant le test de Bonferroni (p < 0,05).
5. Conclusions
La capacité anti-inflammatoire de l’extrait de rhizome d’A. mollis a été médiée par une diminution de la production de NO et par la prévention des dommages causés par le stress oxydant, à la fois par le piégeage des ROS et par le système enzymatique antioxydant cellulaire. Nos résultats suggèrent que l’extrait hexanique des rhizomes d’A. mollis pourrait constituer une source potentielle de produits naturels à activité anti-inflammatoire. L’isolement et la purification d’autres principes actifs de cette plante sont actuellement en cours, avec d’autres études visant à déterminer d’autres mécanismes impliqués dans leur action anti-inflammatoire.