Recherche phytochimique et pharmacologique sur l’extrait d’herbe d’Agrimonia eupatoria L. aux propriétés anti-inflammatoires et hépatoprotectrices
Référence : Plants 2022. — PMC9502318/PMID 36145771 · DOI 10.3390/plants11182371 Type : etude in vivo · Plante : Aigremoine eupatoire · Propriété → Foie & vesicule Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
La plante la plus prometteuse du genre aigremoine (Agrimonia L.) de la famille des Rosaceae pour une utilisation en pratique médicale est Agrimonia eupatoria L. Des recherches phytochimiques et pharmacologiques ont été menées sur l’extrait d’herbe d’Agrimonia eupatoria L., obtenu en utilisant une solution d’éthanol à 40% comme extractant. Au total, 11 monosaccharides libres et 17 monosaccharides liés, ainsi que 17 acides aminés, dont 9 essentiels, ont été trouvés dans l’extrait étudié. Les acides gallique et ellagique, la gallocatéchine, l’épigallocatéchine, la catéchine, l’épicatéchine et le gallate d’épicatéchine ont été identifiés dans l’extrait d’A. eupatoria par la méthode HPLC ; de même, des acides hydroxycinnamiques : hydroxyphénylacétate, acides caféique, syringique, p-coumarique, férulique, sinapique, cinnamique et quinique ; des flavonoïdes : quercétine-3-D-glucoside (isoquercitrine), néohespéridine, naringénine, lutéoline ont été trouvés, et leur teneur quantitative a également été déterminée par des méthodes spectrophotométriques. L’extrait d’herbe d’A. eupatoria appartient aux substances pratiquement non toxiques et possède une activité anti-inflammatoire prononcée (à la dose de 10,0 mg/kg, l’activité anti-exsudative a atteint un maximum en 5 h (88,17%)) et une activité hépatoprotectrice (à la dose de 25 mg/kg, il réduit le niveau d’AlAt respectivement de 1,1 et 1,2 fois ; l’AsAt respectivement de 1,2 et 1,1 fois), réduit le niveau de peroxydation lipidique et stabilise les structures membranaires des cellules hépatiques. Ainsi, l’extrait d’herbe d’A. eupatoria est une substance prometteuse pour la création de phytomédicaments à activité anti-inflammatoire et hépatoprotectrice.
1. Introduction
Ces dernières années, les méthodes de traitement utilisant des plantes médicinales se sont de plus en plus répandues. La recherche de plantes prometteuses dans la flore d’Ukraine, utilisées en médecine populaire et scientifique et disposant d’une base suffisante de matière première, constitue une tâche actuelle de la science pharmaceutique moderne.
Les plantes du genre aigremoine (Agrimonia L.) de la famille des Rosaceae, qui comprend 10 espèces communes dans la zone tempérée de l’hémisphère Nord, en Amérique du Sud et dans les montagnes sous les tropiques, sont des objets prometteurs pour l’étude pharmacognosique. En Ukraine poussent 4 espèces du genre aigremoine : A. eupatoria, A. grandis Andrz. L., A. odorata Mill. et A. pilosa Ledeb.
La plus répandue en Ukraine et utilisée en pratique officinale et populaire est l’aigremoine commune (Agrimonia eupatoria L.). Cette plante est incluse dans le Cadastre d’État du monde végétal d’Ukraine comme espèce prioritaire de plantes médicinales nécessitant des recherches scientifiques.
A. eupatoria contient un grand nombre de substances bioactives diverses : flavonoïdes (quercétine, rutine, hypéroside, cyanidine quercétrine, lutéoline, lutéoline 7-glucoside, apigénine 7-glucoside, astragaline), acides hydroxycinnamiques (caféique, chlorogénique), terpénoïdes, coumarines, saponines, glucides (glucose, fructose, saccharose, galactose, arabinose, rhamnose, xylose, ribose), acides organiques (citrique, malique, oxalique, tartrique, henna), etc.). L’herbe d’A. eupatoria contient également des composés azotés : choline, acide nicotinique, nicotinamide, vitamines K, PP, groupe B et amers. Les échantillons de matières premières d’A. eupatoria cultivées et récoltées en Ukraine ont été peu étudiés ; leur recherche permet une comparaison ultérieure de la composition chimique des matières premières selon les conditions de croissance.
Aujourd’hui, A. eupatoria est utilisée dans la médecine de différents pays du monde. La plante possède un large spectre d’activité pharmacologique : cholérétique, astringente, anti-inflammatoire, antimicrobienne, antivirale, expectorante, diurétique, hémostatique, et normalise le métabolisme.
Dans la médecine scientifique des pays occidentaux et la médecine populaire ukrainienne, A. eupatoria est utilisée comme régulateur des processus métaboliques, pour le traitement des patients atteints de troubles du métabolisme minéral et glucidique : avec divers types de diabète. Les extraits de plante inhibent l’α-glucosidase, ont un effet antidiabétique et jouent un rôle important dans la régulation du métabolisme du glucose. Des scientifiques coréens ont étudié son effet hépatoprotecteur dans les lésions hépatiques chroniques induites par l’éthanol chez le rat. Ils affirment que l’effet hépatoprotecteur d’A. eupatoria est associé à l’inhibition des processus de peroxydation dans les hépatocytes.
Il est donc conseillé de poursuivre les recherches dans l’étude des effets des extraits d’A. eupatoria sur le foie afin de créer de nouveaux phytoremèdes. Dans la pathogenèse des maladies du foie, les effets inflammatoires et toxiques sur les hépatocytes jouent un rôle clé. Il existe plusieurs méthodes classiques fondées sur l’utilisation comme phlogogène du formol, du zymosan et de la carraghénine pour déterminer l’activité anti-inflammatoire des extraits chez les animaux. Nous avons utilisé le formol pour des études de criblage de l’activité anti-inflammatoire de l’extrait. Diverses substances toxiques, telles que l’alcool, le tétrachlorométhane et d’autres cytotoxiques, peuvent être utilisées pour endommager les hépatocytes animaux. Le choix s’est porté sur l’utilisation de la technique au tétrachlorométhane, qui s’était révélée efficace dans l’étude de nombreux autres objets.
Selon les données du Registre d’État des médicaments d’Ukraine, deux médicaments sont enregistrés, dont la composition comprend des SAB d’A. eupatoria : Salvat et Prosalad. La riche expérience de l’utilisation d’A. eupatoria dans la médecine populaire de différents pays du monde et les possibilités des technologies modernes ont conduit à la création de 12 compléments fonctionnels et alimentaires, qui comprennent des SAB d’A. eupatoria (Amersan, Eugastrin, Cynarosan, Novocholin, Nontusyl, Natusor Farinol, etc.).
L’étude présente une nouveauté et une hypothèse : il a été montré qu’une solution d’éthanol à 40% (v/v) est l’extractant optimal pour obtenir un extrait sec à partir de l’herbe d’A. eupatoria. Il est utile d’étudier la composition chimique et l’activité pharmacologique de l’extrait d’A. eupatoria obtenu avec une solution d’éthanol à 40% afin de créer une perspective pour la création d’un nouveau médicament hépatoprotecteur et anti-inflammatoire.
L’objectif de la présente étude était d’étudier la composition chimique ainsi que la toxicité aiguë, l’activité anti-inflammatoire et l’activité hépatoprotectrice de l’extrait d’herbe d’A. eupatoria L.
2. Résultats et discussion
2.1. Recherche phytochimique
L’extrait sec obtenu à partir de l’herbe d’A. eupatoria est une poudre libre de couleur brune avec une odeur spécifique. Le rendement de l’extrait est de 18,26 ± 0,98%.
La détermination des monosaccharides dans l’extrait d’herbe d’A. eupatoria a été réalisée par la méthode GC/MS sur chromatographe Agilent 6890N/5973inert (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis) sur colonne capillaire HP-5ms (30 m × 0,25 mm × 0,25 mkm, Agilent Technologies, États-Unis).
[ ]
Dans l’extrait étudié, 11 monosaccharides libres ont été détectés, 3 ont été identifiés : D-glucose, D-galactose et D-fructose, dont les teneurs étaient respectivement de 120,16 mg/g, 2,82 mg/g et 116,11 mg/g.
Après hydrolyse acide, la présence et la teneur quantitative de 17 monosaccharides ont été déterminées dans l’extrait d’herbe d’A. eupatoria, dont 8 ont été identifiés : D-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-mannose, D-glucose, D-galactose, D-mannitol et D-dulcitol.
Le D-glucose domine parmi les monosaccharides dans l’extrait étudié, sa quantité ayant presque doublé après hydrolyse acide, et sa teneur était de 238,8 mg/100 g.
La détermination quantitative de la teneur en acides aminés a été réalisée sur un analyseur d’acides aminés AAA T-339 M (Mikrotehna, Prague, République tchèque) en comparaison avec la concentration d’acides aminés standards. La recherche a été menée sur la base du centre d’essais de l’Institut d’élevage du bétail de l’Académie nationale des sciences, Kharkiv. Les résultats des études de la composition qualitative et de la teneur quantitative des acides aminés dans l’extrait d’herbe d’A. eupatoria sont présentés.
[ ]
Selon les données obtenues, 17 acides aminés, dont 9 essentiels, ont été détectés et identifiés dans l’échantillon étudié d’extrait d’herbe d’A. eupatoria. L’acide aspartique, la glycine (respectivement 9,03 et 8,93 mg/100 mg), l’alanine, la valine (respectivement 5,69 et 6,19 mg/100 mg) et la lysine (5,03 mg/100 mg) dominent quantitativement. La teneur quantitative de la somme des acides aminés est de 7,18 g pour 100 g d’extrait.
Dans notre travail précédent étudiant la plante Leonurus cardiaca L., nous avons montré que l’ajout d’acides aminés à l’extrait végétal peut renforcer une partie de son activité biologique. Ainsi, l’effet peut également être influencé par l’ensemble des acides aminés synthétisés par la plante.
La détermination des composants tanniques, des acides hydroxycinnamiques et des flavonoïdes dans l’extrait d’herbe d’A. eupatoria a été réalisée par la méthode HPLC sur chromatographe Agilent 1200 3D LC System Technologies (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis).
[ ]
Les substances suivantes des fragments tanniques ont été identifiées par la méthode HPLC dans l’extrait d’herbe d’A. eupatoria : deux fragments de tanins hydrolysables (acides gallique et ellagique), quatre catéchines simples (gallocatéchine, épigallocatéchine, catéchine et épicatéchine) et une catéchine complexe (gallate d’épicatéchine). Les plus communes, l’épicatéchine et l’épigallocatéchine, ont été trouvées dans l’extrait d’herbe d’A. eupatoria : respectivement 1160 et 970 mg/100 g. Selon la revue, A. eupatoria contient au moins 2% de tanins, dont 3-21% sont des tanins condensés ; en particulier, les proanthocyanidines sont présentes principalement sous forme de leuco-anthocyanines bioconverties par hydrolyse acide en cyanidine. Les tanins ont démontré des propriétés antiseptiques, astringentes, antioxydantes, anti-inflammatoires et antimutagènes.
Les acides hydroxycinnamiques (hydroxyphénylacétate, acides caféique, syringique, p-coumarique, férulique, sinapique, cinnamique et quinique (69,73 mg/100 g)) ont été identifiés dans l’extrait d’herbe d’A. eupatoria par la méthode HPLC.
[ ]
L’acide caféique et l’acide ellagique présentent des actions antioxydantes et anti-inflammatoires. De plus, l’acide caféique régule à la baisse les médiateurs inflammatoires nitric oxide synthase, COX-2 et TNF-α. L’acide p-coumarique inhibe la production d’espèces réactives de l’oxygène, possède une activité antiangiogénique, anti-infectieuse, antioxydante, agit comme piégeur de radicaux libres, protège les îlots pancréatiques, prévient les lésions myocardiques et pulmonaires. L’acide férulique possède des effets antibactériens, anti-inflammatoires et autres. Les acides hydroxyphénylacétate et p-coumarique prédominent parmi les acides hydroxycinnamiques dans l’extrait d’herbe d’A. eupatoria. L’acide hydroxyphénylacétate possède des propriétés antiagrégantes. L’acide p-coumarique présente des propriétés antioxydantes, qui conduisent à une diminution du risque de développement du cancer de l’estomac du fait d’une diminution de la formation de nitrosamines carcinogènes. Dans des expériences in vitro, l’acide p-coumarique a montré une activité anti-inflammatoire prononcée. De plus, l’acide p-coumarique exerce des effets hépatoprotecteurs et hypolipidémiants.
À la suite de la recherche, 4 flavonoïdes ont été déterminés dans l’extrait d’herbe d’A. eupatoria par la méthode HPLC.
[ ]
La néohespéridine, qui appartient aux glycosides amers des flavanones et confère un goût amer à la matière première ainsi qu’un effet possible sur le système hépatobiliaire, prédomine parmi les flavonoïdes dans l’extrait d’herbe d’A. eupatoria. Ce flavonoïde possède un effet sédatif en association avec la diosmine. De plus, la néohespéridine présente une activité hypolipidémiante et hypotensive. En général, les flavonoïdes possèdent un potentiel antioxydant, anti-inflammatoire et antiallergique significatif. Le kaempférol et ses glycosides possèdent des propriétés antimicrobiennes et analgésiques ; la lutéoline est une flavone piégeuse d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote. L’étude de Karlinska et al. a indiqué que les deux plantes A. eupatoria et A. procera sont potentiellement de bonnes sources de polyphénols, y compris en particulier de glycosides flavonoïdiques d’apigénine, de lutéoline et de quercétine. La quercétine-3-D-glucoside (isoquercitrine), la néohespéridine, la naringénine et la lutéoline ont été identifiées parmi les flavonoïdes par la méthode HPLC dans l’extrait d’herbe d’A. eupatoria.
Les résultats de la détermination de la teneur des principaux groupes de SAB des composés phénoliques dans l’extrait d’herbe d’A. eupatoria par la méthode spectrophotométrique sont donnés.
Ainsi, les données obtenues seront utilisées pour le développement de méthodes de standardisation de l’extrait, et l’extrait obtenu, sur la base de sa composition chimique, est une substance prometteuse pour le développement d’une forme pharmaceutique et l’étude de son activité anti-inflammatoire et hépatoprotectrice.
2.2. Activité pharmacologique
2.2.1. Activité anti-inflammatoire
Les résultats des études menées montrent que l’extrait sec d’herbe d’A. eupatoria présente une activité anti-inflammatoire sur le modèle d’inflammation au formol, provoquée par l’introduction de 0,1 mL d’une solution aqueuse de formol à 2% sous l’aponévrose de la plante de la patte postérieure. Des expériences ont été menées sur des rats mâles blancs linéaires.
[ ]
[ ]
[ ]
L’effet anti-oedémateux de l’extrait d’herbe d’A. eupatoria a été observé dès 1 h après le début du traitement, ce qui a réduit le gonflement de 66,19%, et il a atteint un maximum en 5 h (88,17%). Il a été établi que l’activité anti-exsudative la plus prononcée est montrée par l’extrait d’herbe d’A. eupatoria à la dose de 10,0 mg/kg.
A. eupatoria exerce un effet immunoprotecteur, diminue les niveaux de cytokines pro-inflammatoires tout en augmentant ceux des cytokines anti-inflammatoires. Il a été montré qu’elle interfère avec la régulation du NO, stimule l’expression et l’activité des enzymes antioxydantes superoxyde dismutase, catalase et glutathion, et piège les radicaux libres. Santos et al. ont étudié l’activité anti-inflammatoire in vitro à la fois de l’infusion d’A. eupatoria et de la fraction enrichie en polyphénols purifiée avec du n-hexane et de l’acétate d’éthyle. Les deux extraits ont réduit significativement les niveaux de NO produits par les macrophages dans des macrophages de lignée cellulaire murine (RAW 264.7) sans affecter négativement la viabilité cellulaire. Une réduction du NO a été observée aux concentrations de 382 µg/mL et 138 µg/mL, respectivement. Les effets anti-inflammatoires et analgésiques des extraits aqueux d’aigremoine dépourvus d’effet toxique ont également été documentés dans des conditions in vivo. Ivanova et al. ont étudié les effets de la consommation pendant un mois de thé d’A. eupatoria chez des volontaires sains. Les résultats indiquent que le thé possède un potentiel d’amélioration des marqueurs du métabolisme lipidique, du statut oxydatif et de l’inflammation. Les saponines triterpénoïdes non étudiées par nous montrent des effets anti-inflammatoires, antioxydants et antimicrobiens. De plus, en médecine traditionnelle, la plante est utilisée depuis longtemps pour traiter l’inflammation pulmonaire, les affections inflammatoires de la muqueuse orale et les maladies du foie.
2.2.2. Toxicité aiguë et activité hépatoprotectrice
L’étude de la toxicité aiguë a montré que l’extrait d’herbe d’A. eupatoria appartient aux substances pratiquement non toxiques lorsqu’il est administré par voie intragastrique (LD50 > 5000 mg/kg). À la suite de la recherche menée, il a été établi que l’administration intragastrique de l’extrait d’herbe d’A. eupatoria à des doses de 8000-10 000 mg/kg ne conduit pas à la mort des animaux, que des changements dans la structure morphologique des organes internes des animaux expérimentaux ne se produisent pas, ce qui indique l’absence d’effets toxiques de l’extrait et les caractérise comme pratiquement non toxiques (classe de toxicité V) selon la classification des substances par toxicité. Selon les recommandations du Centre d’expertise d’État du ministère de la Santé d’Ukraine, il est impossible d’établir la dose létale moyenne du médicament dans ce cas.
Les résultats de l’étude des propriétés hépatoprotectrices de l’extrait d’herbe d’A. eupatoria sur le modèle d’hépatite aiguë au tétrachlorométhane sont présentés.
[ ]
Les études menées ont montré que, pendant le développement de l’hépatite toxique modèle, une augmentation significative du niveau de la peroxydation lipidique générale de 4,5 fois et dépendante de l’ascorbate de 5,2 fois a été observée par rapport aux animaux intacts. La destruction des membranes des hépatocytes est mise en évidence par une augmentation de 4,8 fois et de 2,4 fois de l’activité des enzymes AlAt et AsAt, ce qui est véridique chez les animaux intacts.
L’extrait d’A. eupatoria à la dose de 25 mg/kg et le médicament de référence Silibor ont réduit de façon véridique le niveau de peroxydation lipidique générale et dépendante de l’ascorbate par rapport au modèle d’hépatite. L’extrait d’A. eupatoria et Silibor sont relativement actifs (réduction du niveau d’AlAt respectivement de 1,1 et 1,2 fois ; AsAt respectivement de 1,2 et 1,1 fois), en termes de niveau d’inhibition des processus cytolytiques.
Dans le foie, l’herbe d’A. eupatoria inhibe la signalisation TLR-4 et aide à atténuer les lésions hépatiques. Les extraits aqueux préparés à partir des parties aériennes (tiges et feuilles) d’A. eupatoria et d’A. pilosa ont inhibé la sécrétion de l’antigène de surface de l’hépatite. L’effet hépatoprotecteur de l’extrait aqueux d’A. eupatoria a également été prouvé par un essai clinique sur 80 sujets présentant des niveaux élevés d’alanine transaminase, dans une étude randomisée, en double aveugle, contrôlée par placebo, de 8 semaines. Il a été montré que l’extrait protège contre les lésions hépatiques en raison de ses activités hypolipidémiantes et antioxydantes. L’effet d’A. eupatoria sur le tissu hépatique semble être encore plus large : Kwon et al. suggèrent que l’extrait aqueux préparé à partir des parties aériennes d’A. eupatoria et de certaines autres plantes du genre Agrimonia contient une activité antivirale potentielle contre le virus de l’hépatite B.
Ainsi, les résultats obtenus indiquent que l’extrait sec d’herbe d’A. eupatoria possède un effet hépatoprotecteur prononcé, réduit le niveau de peroxydation lipidique et stabilise les structures membranaires des cellules hépatiques.
3. Matériels et méthodes
3.1. Produits chimiques et expériences générales
L’eau désionisée a été produite à l’aide d’une station Millipore Simplicty UV (Merck Millipore, Burlington, MA, États-Unis). L’acétonitrile, l’acide formique, la pyridine, l’éthanol, le méthanol, le chlorure d’hydroxylamine hydrogène, l’anhydride acétique, le dichloroéthane, l’acide chlorhydrique, l’heptane, l’acétate d’éthyle, le formol, le tétrachlorométhane ont été achetés auprès de VWR (Radnor, PA, États-Unis). L’acide chlorogénique, la rutine, le pyrogallol ont été achetés auprès de Carl Roth (Karlsruhe, Allemagne). L’hydroxyphénylacétate, les acides caféique, syringique, p-coumarique, férulique, sinapique, cinnamique, quinique ainsi que la rutine, la quercétine-3-D-glucoside (isoquercitrine), la naringine, la néohespéridine, la quercétine, la naringénine, le kaempférol, le sorbitol, la lutéoline et le chlorure d’aluminium ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Sant Louis, MI, États-Unis).
3.2. Matériel végétal
La matière première de départ pour obtenir l’extrait sec était l’herbe broyée d’A. eupatoria, récoltée en 2019 pendant la floraison massive des plantes aux environs du village de Vovchyntsi, district de Tysmenetska, région d’Ivano-Frankivsk (48.95890196269463, 24.753323924067537). Environ 1 kg de matériel végétal (15-20 cm des parties supérieures des plantes en fleurs) a été collecté au même lieu de croissance. L’identité de la plante a été établie avec l’aide consultative du professeur A.R. Grytsyk de l’Université nationale de médecine d’Ivano-Frankivsk (IFNMU) selon le catalogue botanique. Les spécimens témoins No. 423-428 ont été déposés au Département de gestion pharmaceutique, de technologie des médicaments et de pharmacognosie, Université nationale de médecine d’Ivano-Frankivsk. La matière première a été séchée pendant 10 jours à température ambiante dans une zone bien ventilée pendant dix jours et stockée dans des sacs en papier.
3.3. Préparation de l’extrait
L’objet de l’étude était l’extrait sec d’A. eupatoria. 50 g d’herbe séchée d’A. eupatoria ont été broyés à une taille de particules de 0,5-3 mm et la perte à la dessiccation a été testée. Le matériel végétal a été placé dans un ballon, versé dans 750 mL d’une solution d’éthanol à 40% (v/v), chauffé sous reflux dans un bain-marie pendant 30 min et extrait pendant 4 h à température ambiante. Après isolement de l’extrait, une nouvelle portion du même extractant (750 mL) a été ajoutée au résidu et une extraction répétée a été réalisée dans les mêmes conditions. L’extrait liquide obtenu a été séché dans une étuve sèche à la température de 50-60 °C jusqu’à une teneur en humidité ne dépassant pas 5%.
3.4. Recherche phytochimique
3.4.1. Monosaccharides
La détermination des monosaccharides libres a été réalisée par la méthode de chromatographie gaz-liquide-spectrométrie de masse sur chromatographe (GC/MS) Agilent 6890N/5973 inert (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis). Colonne capillaire HP-5ms (30 m × 0,25 mm × 0,25 mkm, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis). La température de l’évaporateur est de 250 °C, la température de l’interface est de 280 °C. La séparation a été réalisée en mode de programmation de température : la température initiale de 160 °C a été maintenue pendant 8 min, puis elle a été augmentée avec un gradient de 5 °C/min jusqu’à 240 °C. La température finale a été maintenue pendant 6 min. L’échantillon d’un volume de 1 μL a été injecté en mode de division de flux 1:50. La détection a été réalisée en mode SCAN dans la plage (38-400 m/z). Le débit du gaz vecteur à travers la colonne est de 1,2 μL/min.
Préparation de l’échantillon et analyse de l’extrait. Une portion de 50 mg de l’extrait a été placée dans un ballon à fond rond, et 5,0 mL d’une solution d’éthanol P à 80% (v/v) avec un étalon interne (sorbitol) ont été ajoutés à raison de 500 μg par échantillon. L’extraction des monosaccharides libres a été réalisée dans un bain-marie à 100 °C à l’aide d’un condenseur à reflux pendant 2 h. Pour obtenir des dérivés aldonitriles des monosaccharides, 2 mL de l’extrait ont été prélevés, évaporés à sec sur évaporateur rotatif, et 0,3 mL de réactif de dérivatisation (32 mg/mL de chlorure d’hydroxylamine hydrogène dans un mélange pyridine/méthanol (4:1 v/v)) ont été ajoutés. L’extrait dissous a été maintenu pendant 25 min à 75 °C. 1 mL d’anhydride acétique a été ajouté et maintenu pendant 15 min à 75 °C pour l’acétylation des dérivés aldonitriles des monosaccharides. 2 mL de dichloroéthane ont été ajoutés au mélange réactionnel, et l’excès de réactifs de dérivatisation a été éliminé par double extraction avec une solution 1N d’acide chlorhydrique et de l’eau purifiée. La couche de dichloroéthane a été séchée à sec et dissoute dans 300 μL d’un mélange heptane/acétate d’éthyle (1:1 v/v).
L’identification des monosaccharides du mélange étudié a été effectuée en comparant les temps de rétention des monosaccharides standards et en utilisant la bibliothèque de spectres de masse NIST 02. L’analyse quantitative a été effectuée par ajout d’une solution de l’étalon interne aux échantillons testés. Une solution de sorbitol a été utilisée comme étalon interne.
La masse des monosaccharides par 100 g de matière première en μg a été calculée selon la formule : (1) X = Sx × Mvn.st. × 100 / Spa.is. × m où : Sx est l’aire du pic du monosaccharide étudié ; Mvn.st. - masse de l’étalon interne par échantillon ; Spa.is. - aire du pic de l’étalon interne ; m est le poids de la matière première, en grammes. Trois répétitions technologiques ont été réalisées.
3.4.2. Acides aminés
La détermination des acides aminés a été réalisée sur un analyseur d’acides aminés AAA T-339 M (Mikrotehna, Prague, République tchèque).
Préparation de l’échantillon et analyse de l’extrait. L’extrait de poids sec (100 μg) a été placé dans un tube à essai pour hydrolyse et 5 mL d’eau purifiée ont été ajoutés, mélangés, et une quantité égale d’acide chlorhydrique concentré a été ajoutée. L’hydrolyse a été réalisée à une température de 120 °C pendant 15 min. Après cela, l’échantillon a été neutralisé avec de l’hydroxyde de sodium sec jusqu’à pH 11, transféré dans une capsule en porcelaine pendant 1 h afin d’accélérer l’évaporation de l’ammoniac. La solution d’acide chlorhydrique a été ajoutée pour régler le pH à 2,2. L’échantillon a été filtré. 0,1-0,5 mL de liquide ont été prélevés, après quoi il a été porté à un volume de 2 mL avec une solution tampon. Le volume d’échantillon est de 50 μL.
L’identification et la quantification des acides aminés ont été réalisées dans l’hydrolysat de l’extrait en comparaison avec la concentration des acides aminés standards. Trois répétitions technologiques ont été réalisées.
3.4.3. Fragments tanniques
La composition qualitative et la teneur quantitative des fragments tanniques dans l’extrait ont été déterminées par HPLC sur un chromatographe Agilent 1200 3D LC System Technologies (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis).
Comme phase mobile, le solvant A a été utilisé, qui est constitué d’acide trifluoroacétique à 0,1%, d’acétonitrile à 5% et d’eau purifiée P, le pH de la solution étant de 2,08, et le solvant B est constitué d’acide trifluoroacétique à 0,1% et d’acétonitrile. Le mode de chromatographie est un débit maximal de phase mobile de 0,1 mL/min, qui correspond à la pression de travail maximale de l’éluant 400 bar (40 kPa) ; la température du thermostat de colonne est de 25 °C ; le volume de l’échantillon injecté est de 5-20 μL, le temps de chromatographie est de 40 min. Gradient d’élution : 0 min 100% « B », 8 min 12% « B », 10 min 12% « B », 15 min 25% « B », 20 min 25% « B », 25 min 75% « B », 28 min 75%, 29 min 100%. Le temps de balayage est de 0,6 s, la plage de détection est 190-400 nm, la longueur d’onde est 280, 255 nm.
La préparation de l’échantillon a été réalisée comme suit : le MPM haché a été pesé avec une masse de 100,0 mg (mesure exacte), extrait avec 50,0 mL de solution de méthanol à 95% dans un bain à ultrasons à 80 KHz et 45 °C pendant 30 min. L’extrait a été refroidi et filtré, le filtrat a été évaporé à 50 °C dans un évaporateur rotatif. Le résidu sec a été filtré à travers un filtre à membrane avec un diamètre de pores de 0,45 μm dans 100 mL de phase mobile A avant chromatographie. Trois répétitions technologiques ont été réalisées.
3.4.4. Acides hydroxycinnamiques et flavonoïdes
La composition qualitative et la teneur quantitative des flavonoïdes et des acides hydroxycinnamiques ont été déterminées par HPLC sur un chromatographe Agilent 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis).
L’acétonitrile (éluant A) et une solution d’acide formique à 0,1% dans l’eau (éluant B) ont été utilisés comme phases mobiles. La séparation a été effectuée sur une colonne ZorbaxSB-C18 (pour les flavonoïdes), Zorbax SB-Aq (pour les acides hydroxycinnamiques) (3,5 μm, 150 mm × 4,6 mm) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis). Le mode de chromatographie est un débit du gaz vecteur à travers la colonne de 0,25 mL/min, température du thermostat 30 °C, volume d’injection 4 μL. L’élution a été effectuée en mode gradient.
[ ]
La préparation des échantillons pour l’analyse consistait à dissoudre 50 mg (mesure exacte) de l’extrait dans 5 mL de solution d’éthanol à 60% (v/v) (pour les acides hydroxycinnamiques) ou 70% (v/v) (pour les flavonoïdes) dans un bain à ultrasons à 80 °C pendant 1 h. L’expérience a été conduite dans des flacons hermétiques en verre avec des bouchons en téflon. L’extrait obtenu a été centrifugé à 3000 rpm et filtré à travers des filtres à membrane jetables avec des pores de 0,22 μm.
La détection a été réalisée à l’aide d’un détecteur à matrice de diodes avec enregistrement du signal aux longueurs d’onde de 250, 275 nm (pour les acides hydroxycinnamiques) et 280, 365 nm (pour les flavonoïdes) et fixation des spectres d’absorption dans la plage de 210-700 nm.
L’identification et l’analyse quantitative ont été réalisées en utilisant des solutions standards de composés phénoliques : hydroxyphénylacétate, acides chlorogénique, caféique, syringique, p-coumarique, férulique, sinapique, cinnamique, quinique et rutine, quercétine-3-D-glucoside (isoquercitrine), naringine, néohespéridine, quercétine, naringénine, kaempférol et lutéoline.
La teneur des composés (X) en mg/100 g est déterminée par la formule : (2) X = C × V / m où : C est la concentration du composé, déterminée chromatographiquement, en mg/mL ; V est le volume d’extrait, en ml ; m est la masse de l’extrait étudié, en grammes. Trois répétitions technologiques ont été réalisées.
3.4.5. Méthodes de spectrophotométrie
Détermination de la teneur quantitative en flavonoïdes totaux
La détermination quantitative de la quantité de flavonoïdes en équivalent rutine a été déterminée par une méthode fondée sur la réaction de complexation des flavonoïdes avec le chlorure d’aluminium. L’absorption maximale du complexe flavonoïde a été observée par le chlorure d’aluminium à une longueur d’onde de 410 nm. 6-7 répétitions technologiques ont été réalisées.
100,0 mg (poids exact) de l’extrait ont été placés dans un ballon à fond rond de 100,0 mL et dissous dans de l’éthanol à 70% (v/v) dans un rapport de 1:30 dans un bain-marie à reflux pendant 30 min à la température d’ébullition du solvant. L’extrait a été filtré dans une fiole jaugée de 100,0 mL et complété au trait avec l’extractant puis mélangé.
1,0 mL de l’extrait, 1,0 mL de solution de chlorure d’aluminium à 2% (m/v) dans de l’éthanol à 96%, 2 gouttes d’acide acétique glacial ont été ajoutés dans un ballon à fond rond d’une capacité de 25,0 mL. Le volume de la solution a été porté au trait avec de l’éthanol à 96%. La densité optique de la solution obtenue a été mesurée sur spectrophotomètre Specol 1500 (Neuchâtel, Suisse) à une longueur d’onde de 410 nm dans une cuvette avec une épaisseur de couche de 10 mm.
La solution contenant 1,0 mL de l’extrait, deux gouttes d’acide acétique glacial et ajustée au trait avec de l’éthanol à 96% dans une fiole jaugée de 25,0 mL a été utilisée pour comparaison. En parallèle, dans les mêmes conditions, la densité optique d’une solution contenant 1,0 mL d’une solution à 0,05% d’un échantillon standard de rutine (m/v), préparée de façon similaire à la solution étudiée, a été mesurée.
La teneur en flavonoïdes en équivalent rutine et en matières premières absolument sèches a été calculée selon la formule (3) : (3) X = A1 × m0 × 1 × 100 × 25 × 100 × 100 / A0 × m × 100 × 3 × 25 × (100 - W) où : A1 est la densité optique de la solution étudiée ; m0 est le poids d’un échantillon standard de rutine, en grammes ; A0 est la densité optique de la solution de rutine de l’échantillon standard ; m1 - poids de matière première, en grammes ; W - perte de masse pendant le séchage de l’extrait, en %.
Préparation d’une solution d’un échantillon standard de rutine : 0,05 g (pesé précisément) de rutine standard (FS 42-2508-87), séché jusqu’à poids constant à une température de 130-135 °C, a été dissous dans une fiole jaugée de 100 mL dans une petite quantité d’éthanol à 96% sous chauffage dans un bain-marie bouillant, refroidi et le volume de la solution a été porté au trait avec le même éthanol (1 mL de la solution de l’échantillon standard contient 0,0005 g de rutine).
Détermination de la teneur quantitative en dérivés d’acide hydroxycinnamique
La teneur en dérivés d’acide hydroxycinnamique en équivalent acide chlorogénique dans l’extrait a été déterminée par spectrophotométrie. 6-7 répétitions technologiques ont été réalisées.
100,0 mg (poids exact) de l’extrait ont été dissous dans une solution d’éthanol à 20% (v/v) dans une fiole de 200 mL. La solution est filtrée, le filtrat est transféré quantitativement dans une fiole jaugée de 250,0 mL et le volume est porté au trait avec le même solvant.
1 mL de la solution d’extrait est ajouté à une fiole jaugée de 25,0 mL et le volume de la solution est porté au trait avec une solution d’éthanol à 20% (v/v). La densité optique de la solution obtenue a été mesurée sur un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 327 nm. Une solution d’éthanol à 20% (v/v) a été utilisée comme solution de comparaison.
La teneur de la somme des acides hydroxycinnamiques en équivalent acide chlorogénique en pourcentage a été calculée selon la formule (4) : (4) X = A × 250 × 25 × 100 / 531 × m × 1 × (100 - W), où : A est la densité optique de la solution étudiée ; m - masse de matière première, en grammes ; 531 - indice spécifique d’absorption de l’acide chlorogénique ; W - perte de masse pendant le séchage de l’extrait, en %.
Détermination de la teneur quantitative en tanins
La teneur quantitative en tanins en équivalent pyrogallol a été déterminée par la méthode de la SPhU 2.1. 6-7 répétitions technologiques ont été réalisées.
100,0 mg (poids exact) de l’extrait sont placés dans un ballon à fond rond d’une capacité de 250 mL, dissous dans l’eau et le volume de la solution est porté à 250 mL avec de l’eau, filtré à travers un papier filtre d’un diamètre de 125 mm. Jeter les premiers 25 mL de filtrat.
5,0 mL de la solution d’extrait sont portés à 25,0 mL avec de l’eau. Un mélange de 2,0 mL de la solution obtenue, 1,0 mL de réactif phosphomolybdotungstique et 10,0 mL d’eau est ajusté à un volume de 25,0 mL avec une solution de 290 g/L de carbonate de sodium. Après 30 min, mesurer la densité optique de la solution à une longueur d’onde de 760 nm (A1), en utilisant l’eau comme solution de compensation.
0,10 g d’échantillon standard de poudre de peau est ajouté à 10 mL de filtrat et agité vigoureusement pendant 60 min. Le mélange est filtré et 5,0 mL du filtrat sont portés à un volume de 25,0 mL avec de l’eau.
Un mélange de 2,0 mL de la solution obtenue, 1,0 mL de réactif phosphomolybdotungstique et 10,0 mL d’eau est ajusté à un volume de 25,0 mL avec une solution de 290 g/L de carbonate de sodium. Après 30 min, mesurer la densité optique de la solution à une longueur d’onde de 760 nm (A2), en utilisant l’eau comme solution de compensation.
Solution standard
Immédiatement avant la mesure, 50,0 mg de pyrohalol sont dissous dans l’eau R et le volume de la solution est ajusté à 100,0 mL avec le même solvant. 5,0 mL de la solution résultante sont portés à un volume de 100,0 mL avec de l’eau P.
Un mélange de 2,0 mL de la solution obtenue, 1,0 mL de réactif phosphomolybdotungstique P et 10,0 mL d’eau P est ajusté à un volume de 25,0 mL avec une solution de 290 g/L de carbonate de sodium P. Après 30 min, mesurer la densité optique (2.2.25) de la solution à une longueur d’onde de 760 nm (A3), en utilisant l’eau R comme solution de compensation.
La teneur en tanins, en équivalent pyrogallol, en pourcentage, est calculée par la formule (5) : (5) X = 62,5 × (A1 - A2) × m2 / A3 × m1 × 100, où m1 est la masse de l’échantillon testé, g ; m2 est la masse de pyrogallol, g.
3.5. Activité pharmacologique
L’étude des activités pharmacologiques de l’extrait d’herbe d’A. eupatoria a été réalisée avec l’aide consultative de différents experts du domaine. Le travail expérimental a été réalisé dans le cadre d’un criblage pharmacologique simple. Les expériences ont été réalisées sur des souris blanches non linéaires et des rats Wistar, élevés dans le vivarium de l’IFNMU, standardisés par des paramètres physiologiques et biochimiques et maintenus dans des conditions de vivarium conformément aux normes d’hygiène. Tous les sujets ont donné leur consentement éclairé pour l’inclusion avant de participer à l’étude. L’étude a été menée conformément à la Déclaration d’Helsinki, et le protocole a été approuvé par le Comité d’éthique de la Commission d’éthique de l’Université médicale d’Ivano-Frankivsk (protocole No. 114/20 daté du 21 mai 2020, « Studies of some wild and cultivated medicinal plants of the western region of Ukraine and development drugs based on them », No d’enregistrement d’État 0110U006205). L’expérience a été réalisée conformément aux Principes internationaux de la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et autres fins scientifiques.
3.5.1. Activité anti-inflammatoire
L’étude de l’activité anti-inflammatoire de l’extrait d’herbe d’A. eupatoria a été réalisée sur le modèle d’inflammation au formol, provoquée par l’introduction de 0,1 mL d’une solution aqueuse de formol à 2% (m/v) sous l’aponévrose de la plante de la patte postérieure. Des expériences ont été menées sur des rats mâles blancs linéaires pesant 180-220 g.
Les animaux ont été divisés en 7 groupes de 6 animaux chacun. Le premier groupe : animaux témoins, auxquels on a injecté 0,1 mL de solution aqueuse de formol à 2% (m/v). Les animaux des groupes 2-6 ont reçu par voie orale un extrait d’herbe d’A. eupatoria 2 h et immédiatement après l’introduction de l’agent phlogogène aux doses appropriées. Le septième groupe d’animaux a reçu une substance de référence ayant un effet anti-inflammatoire connu : une teinture de noyer (Juglans regia L.) à la dose de 0,05 mL pour 100 g de poids corporel animal.
Le volume de la patte a été mesuré avec un oncomètre avant le début de l’expérience, après 1 h, après 3 h et au moment du développement maximal du gonflement après 5 h.
L’effet des extraits d’A. eupatoria a été évalué par leur capacité à inhiber le gonflement de la patte chez les rats. L’efficacité anti-inflammatoire a été calculée selon la formule : X = (Vk - V0) × 100 / Vk, où : Vk est l’augmentation moyenne du volume de la patte gonflée dans le témoin ; V0 est l’augmentation moyenne du volume de la patte gonflée chez les animaux traités.
3.5.2. Toxicité aiguë et activité hépatoprotectrice
L’étude de la toxicité aiguë est obligatoire dans le complexe des études précliniques de nouveaux médicaments. La méthode d’étude préclinique de l’innocuité des médicaments a été utilisée pour étudier la toxicité aiguë de l’extrait sec d’herbe d’A. eupatoria.
La recherche a été menée sur des souris blanches non consanguines des deux sexes, obtenues auprès du vivarium de l’IFNMU, pesant 18-22 g et soumises à un régime alimentaire normal. Dans l’expérience, un groupe de 6 animaux a été utilisé, auquel on a injecté une solution aqueuse de l’extrait d’A. eupatoria, ainsi qu’un groupe témoin. Les solutions ont été administrées par voie intragastrique à l’aide d’une sonde métallique à doses croissantes.
Les animaux ont été observés pendant 14 jours. L’effet de l’extrait a été évalué par des indicateurs intégrés (état général, changements de position corporelle, état de la peau, couleur des muqueuses, température corporelle) et des symptômes individuels (diarrhée, somnolence, tremblements, convulsions, etc.).
L’étude de l’activité hépatoprotectrice de l’extrait d’herbe d’A. eupatoria a été réalisée sur le modèle d’hépatite aiguë au tétrachlorométhane. Des expériences ont été menées sur des rats mâles blancs pesant 200-240 g, divisés en 6 groupes de 6-9 animaux. Les lésions hépatiques ont été provoquées chez les animaux des premier à cinquième groupes par une solution huileuse à 50% de tétrachlorométhane à la dose de 0,8 mL pour 100 g de poids animal pendant 2 jours avec un intervalle de 24 h. L’extrait étudié et le médicament de comparaison ont été administrés aux animaux 1 h et 2 h après l’administration du poison hépatotrope.
Les animaux des groupes 2-4 ont reçu une injection d’une solution aqueuse de l’extrait d’herbe d’A. eupatoria aux doses de 50, 25 et 10 mg par 1,0 kg de poids de l’animal, respectivement. Les animaux du cinquième groupe ont reçu le médicament comparatif « Silibor » à la dose de 25 mg par 1,0 kg de poids animal. Le sixième groupe correspond aux animaux intacts (AI).
Les rats ont été décapités le troisième jour après la première injection de tétrachlorométhane. La conclusion concernant l’efficacité pharmacothérapeutique de l’extrait étudié a été faite sur la base des indicateurs biochimiques et fonctionnels de l’état du foie, qui ont été déterminés 24 h après la dernière injection de tétrachloroéthane. Le niveau total de peroxydation lipidique (TLoP) a été déterminé dans les homogénats de foie selon la méthode de L. Ernster, et la peroxydation lipidique dépendante de l’ascorbate (ADL) selon la méthode de L. Ernster dans la modification d’A.I. Archakova, Yu.V. Vladimirova. L’activité des enzymes de cytolyse, alanine aminotransférase (AlAt) et aspartate aminotransférase (AsAt), a été déterminée dans le sérum sanguin en utilisant la méthode de Reitman-Frenkel, qui reflètent l’état des membranes cellulaires des hépatocytes.
3.6. Analyse statistique
Les propriétés statistiques des variables aléatoires ayant une distribution normale à n dimensions sont données par leurs matrices de corrélation, qui peuvent être calculées à partir des matrices originales. Pour l’évaluation statistique, toutes les données pharmacologiques sont rapportées sous forme de moyenne ± SEM et ont été analysées à l’aide du logiciel STATISTICA 6 avec une ANOVA à un facteur. Les valeurs de p inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.
4. Conclusions
À la suite des études phytochimiques et pharmacologiques, il a été montré que l’extrait d’herbe d’A. eupatoria est une substance prometteuse pour la création de médicaments à activité anti-inflammatoire et hépatoprotectrice.