Activités antioxydantes, anti-inflammatoires et analgésiques de l’infusion d’Agrimonia eupatoria L.
Référence : Evidence-based Complementary and Alternative Medicine : eCAM 2017. — PMC5405390/PMID 28491113 · DOI 10.1155/2017/8309894 Type : etude in vivo · Plante : Aigremoine eupatoire · Propriété → Anti-inflammatoire Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
L’aigremoine (Agrimonia eupatoria L.) (Ae) est utilisée en médecine traditionnelle pour traiter les maladies liées à l’inflammation et à l’oxydation. Par conséquent, cette étude porte sur le potentiel anti-inflammatoire et analgésique de l’infusion d’Ae (AeI). La caractérisation des composés phénoliques a été réalisée par HPLC-PDA-ESI/MSn. Pour évaluer le potentiel antioxydant, les essais 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH), anion superoxyde, radical hydroxyle et SNAP ont été utilisés. L’activité anti-inflammatoire in vitro d’AeI a été étudiée dans des macrophages stimulés par le LPS en mesurant la production de NO. L’activité anti-inflammatoire in vivo a été validée à l’aide du modèle d’œdème de la patte induit par la carraghénane chez la souris. Le potentiel analgésique périphérique et central a été évalué à l’aide des tests de contorsions induites par l’acide acétique et de plaque chauffante, respectivement, ainsi que du test à la formaline pour évaluer les deux activités. Le profil de sécurité a été révélé in vitro et in vivo, à l’aide des essais MTT et hématoxyline, respectivement. La vitexine, le quercétine O-galloyl-hexoside et le kaempférol O-acétyl-hexosyl-rhamnoside ont été signalés pour la première fois dans cette espèce. AeI et surtout AePF (fraction polyphénolique d’Ae) ont montré une activité antiradicalaire significative contre tous les radicaux testés. AeI et AePF ont toutes deux diminué les niveaux de NO in vitro, AePF étant plus active qu’AeI. Les activités anti-inflammatoires et analgésiques in vivo ont été vérifiées pour les deux échantillons à des concentrations dépourvues de toxicité. L’infusion d’aigremoine et, principalement, AePF sont des sources potentielles de polyphénols antiradicalaires et anti-inflammatoires.
1. Introduction
Agrimonia eupatoria L., Rosaceae, communément appelée aigremoine, est une herbe dressée, vivace, atteignant 100 cm de haut, le plus souvent non ramifiée, avec une tige cylindrique. Les feuilles pennées sont dentées et couvertes de poils souples. Les fleurs sont hermaphrodites avec 5 pétales jaunes, disposées en épis terminaux grêles. Le fruit est entouré de plusieurs rangées de soies souples en forme de crochet.
Les parties aériennes de l’aigremoine sont utilisées pour préparer des infusions, des décoctions ou des teintures (extraits hydroalcooliques) en médecine traditionnelle, en raison de leurs propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires, astringentes et diurétiques. Néanmoins, seul un petit nombre de travaux scientifiques ont été menés concernant ces activités et les phytoconstituants impliqués. Des acides aromatiques, des triterpènes et des tanins ont été cités. La présence de kaempféride, de kaempférol et de leurs dérivés, tels que le kaempférol 3-O-glucoside, le kaempférol 3-O-rhamnoside et le kaempférol 3-O-rutinoside, a également été rapportée. Cependant, à notre connaissance, peu d’informations scientifiques ont été publiées sur certains de ses composés phénoliques, à savoir les proanthocyanidines, et sur les composés récemment découverts comme les esters glycosylés d’acides phénoliques flavonoïdiques, tels que le kaempférol 3-O-(2′′-O-acétyl-6′′-p-coumaroyl)-glucoside. Les tanins condensés, généralement désignés par proanthocyanidines, sont un groupe de composés phytochimiques qui a été décrit comme de puissants antioxydants. Habituellement, l’activité de piégeage de ces polymères de flavan-3-ol augmente avec le nombre d’hydroxyles, surtout s’ils sont en position ortho sur le cycle B, et pour leurs esters d’acide gallique. L’activité antiradicalaire augmente également des monomères aux trimères, bien qu’elle diminue ensuite.
Les flavonoïdes appartiennent à un vaste groupe de polyphénols, et plusieurs activités biologiques, telles qu’anti-inflammatoire, antiulcéreuse, anticancéreuse, antivirale, antibactérienne, antispasmodique, neuroprotectrice, antiathérosclérotique et antithrombotique, ont été attribuées à ces composés. Le stress oxydatif et la défense antioxydante ont été associés aux maladies inflammatoires, cancéreuses et coronariennes. Le potentiel antioxydant reconnu des flavonoïdes pourrait donc être responsable de leurs actions bénéfiques. De plus, des propriétés anti-inflammatoires, parfois corrélées aux activités antioxydantes, ont également été vérifiées pour ces composés.
Des recherches approfondies au cours des deux dernières décennies ont révélé que la plupart des maladies chroniques, notamment le cancer, le diabète et les maladies cardiovasculaires, sont médiées par l’inflammation chronique, qui constitue actuellement l’une des principales causes de mortalité dans le monde occidental. Malgré le fait que les mécanismes par lesquels cela se produit n’ont pas encore été clarifiés, on sait que les espèces réactives agissent comme seconds messagers déclenchant l’expression aberrante de gènes inflammatoires, tels que les cytokines, les chimiokines, la cyclooxygénase-2 (COX-2) et la synthase inductible de l’oxyde nitrique (iNOS). On sait également que les espèces réactives, ROS et RNS, peuvent activer des cascades de transduction du signal ainsi qu’induire des modifications de facteurs de transcription, qui médiatisent les réponses cellulaires inflammatoires et de stress immédiates. La principale voie initiant ce processus inflammatoire est la voie de signalisation du facteur nucléaire NF-kB. L’inflammation est habituellement associée à la douleur. En fait, de nombreux médiateurs chimiques, à savoir l’histamine, la sérotonine, la bradykinine, les prostaglandines, le TNF-α et les protons, générés pendant l’inflammation, stimulent les récepteurs nociceptifs responsables de la douleur périphérique. Des résultats antérieurs ont démontré qu’un extrait aqueux d’Agrimonia eupatoria présentait un effet marqué de piégeage des radicaux libres contre le radical DPPH et également contre le cation radical ABTS. En général, l’augmentation des substitutions hydroxyles est corrélée à une activité antioxydante plus forte.
La médecine populaire de différents pays rapporte également le fort potentiel anti-inflammatoire des préparations d’A. eupatoria, qui a été corrélé à la réduction de la production de TNF-α, d’IL-1β et d’IL-6 dans des cultures cellulaires de souris. En outre, il a également été rapporté précédemment que l’aigremoine améliorait les lésions hépatiques chroniques induites par l’éthanol et que la protection était probablement due à la suppression du stress oxydatif et de la signalisation inflammatoire médiée par les récepteurs de type Toll (TLR).
Dans nos travaux en cours, nous avons caractérisé des extraits hydroalcooliques d’Agrimonia eupatoria et prouvé qu’ils ont une activité antioxydante prononcée contre les espèces réactives, principalement due à des flavonoïdes spécifiques et/ou à des tanins condensés, identifiés comme des dérivés de flavonol, de flavone et de flavan-3-ol. En conséquence, une étude récente a confirmé la présence de ces composés dans l’aigremoine, et parmi eux figurent des proanthocyanidines, des dérivés d’apigénine, de lutéoline, de quercétine et de kaempférol, mais la catéchine, l’acide chlorogénique et l’acide p-coumarique ont également été identifiés.
Cette étude vise à caractériser l’activité antioxydante de l’infusion d’Agrimonia eupatoria L. et d’une fraction enrichie en polyphénols et à corréler cette bioactivité avec son profil phénolique. En outre, nous avons cherché à évaluer l’activité anti-inflammatoire in vitro de l’infusion et de la fraction enrichie en polyphénols à des concentrations dépourvues de toxicité. Les propriétés anti-inflammatoires et analgésiques de ces échantillons ont été validées à l’aide de modèles in vivo, tandis que les toxicités hépatique et rénale ont été suivies afin de soutenir l’usage traditionnel de cette plante médicinale.
2. Matériels et méthodes
2.1. Matériel végétal, extrait et fractionnement
Les parties aériennes d’Agrimonia eupatoria L. ont été fournies par Segredo da Planta, Portugal (numéro de lot 5870 et données de contrôle qualité n’identifiant aucun défaut), identifiées par la Dre Célia Cabral, et un spécimen de référence (T. Batista 02009) a été déposé à l’Herbier des plantes médicinales et aromatiques, Faculté de pharmacie, Université de Coimbra. L’extrait (infusion) a été préparé conformément aux usages en médecine traditionnelle ; en particulier, 20 g de plante pulvérisée ont été infusés dans 600 mL d’eau pendant 15 min. L’infusion a ensuite été filtrée sous vide et lavée avec du n-hexane (1 : 1) pour éliminer les composés liposolubles. Ensuite, une moitié de l’infusion a été concentrée dans un Rotavapor à 30°C, congelée et lyophilisée (AeI), tandis que l’autre moitié a été fractionnée par extraction répétée avec de l’acétate d’éthyle (Merck, Darmstadt, Allemagne) (3 × 225 mL). Les phases organiques, contenant les polyphénols, ont été recueillies, déshydratées avec du sulfate de sodium anhydre et concentrées avec de l’eau, dans un Rotavapor à 30°C, jusqu’à élimination de tout l’acétate d’éthyle. La fraction d’acétate d’éthyle a été congelée et lyophilisée (AePF).
2.2. HPLC-PDA-ESI/MSn
AeI et AePF ont été analysées par un chromatographe liquide Surveyor équipé d’un détecteur à photodiodes (PDA) (Surveyor) et couplé à un spectromètre de masse Finnigan LCQ (San Jose, CA, États-Unis) équipé d’une chambre d’ionisation API-ES. La séparation a été réalisée sur une colonne en phase inverse Spherisorb® ODS-2 C18, 150 × 2,1 mm de d.i. et taille de particule de 3 μm (Waters Corporation, Milford, Massachusetts, États-Unis) et une cartouche de garde Spherisorb ODS-2 C18 (10 × 4,6 mm de d.i. et taille de particule de 5 μm ; Waters Corporation [Milford, Massachusetts, États-Unis]) à 25°C, en utilisant de l’acide formique aqueux à 2% (A) et du méthanol (B) comme phase mobile. Le profil de gradient utilisé était 5-15% B (0-10 min), 15-30% B (10-15 min), 30-35% B (15-25 min), 35-50% B (25-35 min), 50-80% B (35-40 min) et 80% B (40-60 min), en isocratique, à un débit de 0,2 mL/min. La première détection a été effectuée avec le détecteur PDA dans une plage de longueurs d’onde de 200-600 nm, suivie d’une seconde détection dans le spectromètre de masse.
Les analyses de masse ont été obtenues en mode ion négatif. Le spectromètre de masse a été programmé pour effectuer trois balayages consécutifs : masse complète MS1 (m/z 160-1300), MS2 de l’ion le plus abondant dans MS1 et MS3 de l’ion le plus abondant dans MS2. La tension de source était de 4,5 kV et la tension et la température du capillaire étaient respectivement de -10 V et 250°C. L’azote a été utilisé comme gaz de gaine à un débit de 20 unités arbitraires. L’énergie normalisée de collision était de 45%, en utilisant l’hélium comme gaz de collision.
2.3. Activité antioxydante
L’activité de piégeage des radicaux libres a été évaluée selon la méthode décrite par Blois, 1958. Des aliquotes d’échantillons (100 μL) ont été évaluées par leur réactivité avec une solution méthanolique de DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle) 500 μM (500 μL) (Sigma-Aldrich, Portugal) en présence de tampon acétate 100 mM, pH 6,0 (1 mL). Les mélanges réactionnels (3 mL) ont été conservés pendant 30 min à température ambiante et dans l’obscurité. Les diminutions de l’absorbance ont été mesurées à 517 nm dans un spectrophotomètre Cintra 101, GBC® (Victoria, Australie). Le butylhydroxytoluène (BHT) (Sigma-Aldrich, Portugal) a été utilisé comme composé de référence. Le traitement des données et l’analyse statistique ont été réalisés à l’aide de Microsoft® Excel 2013.
L’essai était fondé sur la réduction du nitroblue tétrazolium (NBT) entraînée par le superoxyde par la riboflavine photochimiquement réduite. Les mélanges réactionnels (3 mL) contenaient du tampon phosphate (16 mM, pH 7,8), 0,1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,8 mM de tétraméthyléthylènediamine (TEMED), 85 μM de nitroblue tétrazolium (NBT), 6 μM de riboflavine et le volume approprié des échantillons. L’essai a été réalisé à température ambiante (22°C) sous éclairage fluorescent (20 W, 20 cm). La réaction a été arrêtée en éteignant la lumière et par l’ajout de 50 μL de superoxyde dismutase (SOD) à 1 mg/mL. L’absorbance a été mesurée à 560 nm. La quercétine a été utilisée comme composé de référence.
La capacité de piégeage du radical hydroxyle a été évaluée à l’aide d’un essai de dégradation du désoxyribose réalisé selon la procédure décrite par Payá et al. Dans un volume final de 1 mL, les mélanges réactionnels contenaient du tampon phosphate 20 mM (pH 7,4), 2,8 mM de 2-désoxy-D-ribose, 104 μM d’EDTA, 20 μM de FeCl3, 0,5 mM de H2O2, 0,1 mM d’acide ascorbique et les aliquotes d’échantillon. Les mélanges ont été conservés à 37°C pendant 1 h puis l’étendue de la dégradation du désoxyribose a été mesurée par l’ajout de 1 mL d’acide thiobarbiturique (TBA) à 1% (p/v) et de 1 mL d’acide trichloroacétique (TCA) à 2,8% (p/v), suivi d’un chauffage à 100°C pendant 20 min. Après refroidissement, l’absorbance a été mesurée à 532 nm. La quercétine a été utilisée comme référence.
2.4. Essais in vitro
Raw 264.7, une lignée cellulaire de macrophages monocytes leucémiques de souris provenant de l’American Type Culture Collection, aimablement fournie par la Dre Otília Vieira (Centro de Neurociências e Biologia Celular, Universidade de Coimbra, Coimbra, Portugal), a été cultivée dans le milieu Iscove’s Modified Dulbecco’s Eagle Medium supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal non inactivé, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine à 37°C dans une atmosphère humidifiée de 95% d’air et 5% de CO2. Au cours des expériences, les cellules ont été surveillées par observation au microscope afin de détecter tout changement morphologique.
L’évaluation des cellules métaboliquement actives a été réalisée en utilisant l’essai colorimétrique de réduction du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium (MTT), comme rapporté précédemment. Des cellules Raw 264.7 (6 × 105 cellules/puits) ont été ensemencées (plaque 48 puits) et laissées à stabiliser pendant 12 h. Après cette période, les cellules ont été soit maintenues en milieu de culture (témoin), soit préincubées avec l’échantillon pendant 1 h puis activées avec 1 μg/mL de LPS (Sigma Chemical Co., États-Unis) pendant 24 h. Après les traitements, une solution de MTT (5 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate) a été ajoutée et les cellules incubées à 37°C pendant 15 min, dans une atmosphère humidifiée de 95% d’air et 5% de CO2. Les surnageants ont ensuite été retirés et les cristaux bleu foncé de formazan solubilisés avec de l’isopropanol acide (0,04 N HCl dans l’isopropanol). La quantification du formazan a été effectuée à l’aide d’un lecteur automatique de microplaques ELISA (SLT, Autriche) à 570 nm, avec une longueur d’onde de référence de 620 nm. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. La significativité statistique a été déterminée par ANOVA à un facteur, suivie du test post hoc de Dunnett.
La production d’oxyde nitrique (NO) a été mesurée par l’accumulation de nitrite dans les surnageants de culture, à l’aide d’une réaction colorimétrique avec le réactif de Griess. Brièvement, 170 μL de surnageants de culture ont été dilués avec des volumes égaux de réactif de Griess [0,1% (p/v) de dichlorhydrate de N-(1-naphtyl)-éthylènediamine et 1% (p/v) de sulfanilamide contenant 5% (p/v) de H3PO4] et maintenus pendant 30 min dans l’obscurité. L’absorbance à 550 nm a été mesurée dans un lecteur automatisé de plaques (SLT, Autriche). Le milieu de culture a été utilisé comme blanc et la concentration en nitrite a été déterminée à partir d’une analyse de régression utilisant des dilutions en série de nitrite de sodium comme étalon. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. La significativité statistique a été déterminée par ANOVA à un facteur, suivie du test post hoc de Dunnett.
L’activité de piégeage de l’oxyde nitrique (NO) a été évaluée en incubant les échantillons avec 150 μM du donneur de NO S-nitroso-N-acétylpénicillamine (SNAP ; Tocris Bioscience, Bristol, Royaume-Uni), dans le milieu Iscove’s Modified Dulbecco’s Eagle Medium (Sigma-Aldrich Química, Madrid, Espagne). La concentration des échantillons a été choisie sur la base de la concentration EC50 des résultats de piégeage du radical DPPH. Après 3 h, les niveaux de nitrite dans le milieu ont été quantifiés par la méthode de Griess, comme décrit ci-dessus. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. La significativité statistique a été déterminée par ANOVA à un facteur, suivie du test post hoc de Dunnett.
2.5. Essais in vivo
Des rats Wistar mâles pesant 160-220 g et des souris mâles pesant 25-30 g ont été obtenus auprès de Charles River (Barcelone, Espagne). Les animaux ont été maintenus avec nourriture et eau ad libitum et gardés à 22 ± 1°C avec un cycle lumière/obscurité contrôlé de 12 heures à la Faculté de pharmacie, Université de Coimbra. Les animaux ont été autorisés à s’adapter au laboratoire pendant 7 jours avant les tests. Pour l’évaluation de l’activité anti-inflammatoire, les rats ont été mis à jeun avec libre accès à l’eau au moins 24 h avant les expériences. Pour étudier l’activité analgésique des échantillons, les souris ont été mises à jeun avec libre accès à l’eau au moins 18 h avant les expériences. La recherche a été menée conformément aux principes internationalement acceptés pour l’utilisation et le soin des animaux de laboratoire tels qu’énoncés dans la Directive 2010/63/UE et le projet a été approuvé par la Direction générale vétérinaire portugaise.
L’infusion d’Agrimonia eupatoria (AeI) et sa fraction d’acétate d’éthyle (AePF) ont été dissoutes dans de l’eau distillée et les doses administrées ont été calculées sur la base des doses traditionnellement utilisées (extrait de 5 g de plante dans 150 mL d’eau), en tenant compte de notre rendement d’extraction par infusion et par processus de fractionnement à l’acétate d’éthyle, ainsi que de la conversion en doses animales, selon les lignes directrices de la FDA (Food and Drug Administration), « Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers ». Afin d’examiner un possible effet dose-dépendant, deux doses différentes ont été utilisées : D1 et D2 (dans l’essai d’inflammation) et D2 et D3 (dans les deux essais d’évaluation de la douleur), selon le modèle animal utilisé. Au cours des études expérimentales, des procédures visant à réduire la subjectivité de l’expérimentateur et à augmenter le biais ont été suivies.
2.5.1. Activité anti-inflammatoire
Pour l’évaluation expérimentale de l’activité anti-inflammatoire, les animaux ont été anesthésiés avec une solution de kétamine sodique (Ketalar®, 50 mg/kg) achetée auprès de Parke-Davis, Pfizer (Seixal, Portugal) et de chlorpromazine (Largactil®, 2,3 mg/kg) auprès de Rhône-Poulenc Rorer, Laboratório Vitória SA (Amadora, Portugal).
Le test de l’œdème de la patte de rat induit par la carraghénane a été utilisé pour évaluer l’activité anti-inflammatoire aiguë in vivo d’AeI et d’AePF, en employant le diclofénac sodique comme médicament de référence. L’œdème de la patte de rat a été évalué par la méthode de déplacement de volume à l’aide d’un pléthysmographe numérique (modèle LE7500, Panlab, Barcelone, Espagne). Avant la réalisation de l’expérience, un pré-essai a été effectué afin de déterminer à quel moment se produit le maximum du volume d’œdème, autrement dit, le maximum d’inflammation. Pour cela, une injection sous-plantaire de 0,1 mL d’une solution de carraghénane à 1% dans du sérum physiologique, administrée dans le coussinet plantaire postérieur droit de chaque animal, a été réalisée, et le volume de la patte a été mesuré à intervalles de 30 min pendant une période de 7 h. Les résultats de cette expérience nous ont montré que la valeur maximale de l’œdème de la patte survient 4 h après l’administration de carraghénane, cette période de temps étant celle utilisée pour l’expérience suivante.
Les rats ont été répartis en quatre groupes (n = 6-8) : le groupe témoin négatif carraghénane a reçu de l’eau 0,5 μL/g p.o., le groupe témoin positif a reçu du diclofénac sodique 10 mg/kg i.p., et les groupes test ont reçu par voie orale AeI (99,59 mg/kg, D1, et 199,18 mg/kg, D2) et AePF (18,12 mg/kg, D1, et 36,24 mg/kg, D2) reconstituées dans de l’eau. Les groupes témoin négatif et test, respectivement, ont reçu le véhicule et les échantillons 1 h, et le groupe témoin positif a reçu le diclofénac sodique 30 min avant l’administration d’une injection sous-plantaire de 0,1 mL d’une solution de carraghénane à 1% dans du sérum physiologique, dans le coussinet plantaire postérieur droit de chaque animal. Le potentiel anti-inflammatoire a été calculé 4 h après l’administration de carraghénane et a été exprimé en pourcentage d’inhibition de l’œdème, pour les animaux traités, par rapport au groupe témoin carraghénane. Le pourcentage d’inhibition de l’œdème a été calculé selon l’équation suivante : % inhibition de l’œdème = 1 − (V**t/V**c) × 100, où V**t est la variation moyenne du volume de la patte chez les rats traités avec AeI, AePF ou le diclofénac sodique et V**c est la variation moyenne du volume de la patte dans le groupe témoin carraghénane. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. La significativité statistique a été déterminée par ANOVA à un facteur, suivie du test post hoc de Tukey.
2.5.2. Activité analgésique centrale
Le test de la plaque chauffante a été utilisé pour évaluer l’activité analgésique centrale d’AeI et d’AePF en mesurant le temps de réaction selon la méthode décrite par Eddy et Leimbach. La morphine a été utilisée comme médicament de référence. Les souris ont été placées individuellement sur une plaque chauffante réglée à 55 ± 1°C (modèle LE7406, PanLab, Barcelone, Espagne). Le temps de réaction, mesuré en secondes, a été enregistré lorsque les animaux léchaient leurs pattes antérieures et sautaient. La valeur de base a été considérée comme le temps de réaction avant traitement et a été mesurée 24 h avant l’expérience. Les souris ont ensuite été réparties aléatoirement en cinq groupes (n = 6-8) : le groupe témoin positif a reçu du chlorhydrate de morphine 10 mg/kg i.p. et les groupes test ont reçu par voie orale AeI (199,18 mg/kg, D2, et 398,26 mg/kg, D3) et AePF (36,24 mg/kg, D2, et 72,48 mg/kg, D3) reconstituées dans de l’eau. Les groupes test ont été dosés 1 h et le groupe témoin positif 30 min avant le placement sur la plaque chauffante pour l’enregistrement du temps de réaction à la température. Le temps limite a été fixé à 30 s pour protéger les animaux. Le pourcentage de capacité analgésique a été calculé en utilisant la formule : % capacité analgésique = 1 − (T**b/T**t) × 100, où T**b est le temps de réaction moyen enregistré comme valeur de base et T**t est le temps de réaction moyen enregistré après traitement par la morphine ou par l’échantillon. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. La significativité statistique a été déterminée par ANOVA à un facteur, suivie du test post hoc de Tukey.
2.5.3. Activité analgésique périphérique
Le test des contorsions induites par l’acide acétique a été réalisé selon la méthode précédemment décrite par Collier et al. Le test a été utilisé pour évaluer l’activité analgésique périphérique d’AeI et d’AePF, en employant le diclofénac sodique comme médicament de référence. L’acide acétique à 0,6% dans du sérum physiologique a été administré i.p. à 0,1 mL/10 g de poids corporel. Le nombre de contorsions, une réponse consistant en la contraction de la paroi abdominale suivie de l’extension des membres postérieurs, a été compté pendant l’observation continue des animaux pendant 30 min, en commençant le comptage 5 min après l’injection. Les animaux ont été répartis en six groupes (n = 6-8) : le groupe témoin négatif a reçu de l’eau 0,5 μL/g p.o., le groupe témoin positif a reçu du diclofénac sodique 10 mg/kg i.p., et les groupes test ont reçu AeI et AePF aux doses mentionnées ci-dessus. Les groupes témoin négatif et test ont été dosés 1 h et le groupe témoin positif 30 min avant l’injection d’acide acétique. Une réduction significative du nombre de contorsions par tout médicament a été considérée comme une réponse analgésique positive. Le pourcentage de capacité analgésique a été calculé en utilisant la formule : % capacité analgésique = 1 − (W**t/W**c) × 100, où W**t est le nombre moyen de contorsions dans les groupes test et témoin positif et W**c est le nombre moyen de contorsions dans le groupe témoin négatif. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. La significativité statistique a été déterminée par ANOVA à un facteur, suivie du test post hoc de Tukey.
2.5.4. Activité analgésique
Le test à la formaline a été réalisé selon la méthode précédemment décrite par Hunskaar et Hole. Le test a été utilisé pour évaluer l’activité analgésique périphérique ou centrale de l’échantillon, en employant respectivement le diclofénac sodique ou le chlorhydrate de morphine comme médicaments de référence. Les souris ont été réparties en quatre groupes (n = 6-8) : un groupe test (72,48 mg/kg d’AePF p.o.), un groupe témoin négatif (eau p.o.), un groupe témoin positif de phase précoce (chlorhydrate de morphine 10 mg/kg i.p.) et un groupe témoin positif de phase tardive (diclofénac sodique 10 mg/kg i.p.). Après 1 heure, pour le groupe test et le groupe témoin négatif, ou 30 min, pour les témoins positifs, les animaux ont reçu par voie sous-cutanée 20 μL de formaline à 1% dans du sérum physiologique à 0,9% dans la patte postérieure dorsale et ont été placés immédiatement dans une boîte transparente pour observation. La durée de léchage de la patte a été déterminée entre 0 et 5 min (phase précoce) et entre 20 et 40 min (phase tardive) après l’injection de formaline. Le temps passé à lécher, en secondes, a été noté.
La capacité analgésique (en pourcentage) a été calculée en utilisant la formule : % capacité analgésique = 1 − (W**t/W**c) × 100, où W**t est le temps moyen passé à lécher dans les groupes test et témoin positif et W**c est le temps moyen passé à lécher dans le groupe témoin négatif. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. La significativité statistique a été déterminée par ANOVA à un facteur, suivie du test post hoc de Tukey.
Cinq heures après l’administration des échantillons, les rats utilisés dans le test de l’œdème de la patte ont été sacrifiés. Les foies et les reins ont été collectés, coupés en fragments transversaux (0,5 cm) et immergés dans une solution de formaldéhyde à 10% pendant une période de 24 h. Les pièces ont été incluses en paraffine et stockées à -20°C. Les fragments ont été coupés en pièces de 4 μm dans un microtome Shandon (AS 325) et colorés à l’hématoxyline (noyaux cellulaires, bleu) et à l’éosine (cytoplasme, rose/rouge). Les images résultantes ont été obtenues et observées (grossissement 20x dans l’original) au microscope Nikon (Eclipse E600).
3. Résultats et discussion
Dans la présente étude, les principaux polyphénols de l’infusion de parties aériennes d’Agrimonia eupatoria ont été identifiés, les résultats démontrant leur contribution aux activités antioxydantes, anti-inflammatoires et analgésiques.
3.1. HPLC-PDA-ESI/MSn
Les profils HPLC ont été enregistrés à 280 nm pour tous les échantillons, la Figure 1 montrant le profil HPLC de la fraction d’acétate d’éthyle enrichie en polyphénols d’Agrimonia eupatoria (AePF). Les maxima d’absorption et les profils ultraviolets obtenus avec le détecteur à barrette de diodes ont permis d’identifier la plupart des pics comme des dérivés de flavan-3-ols (1-10), de quercétine (14, 17-18), de kaempférol (21, 23-26), d’apigénine (13, 15, 19 et 22) et de lutéoline (16) et, dans une moindre mesure, d’agrimoniine (11), d’acide p-coumarique (12) et d’acide ellagique (20). Le Tableau 1 résume les temps de rétention, les maxima des spectres UV, les fragments MSn des pics pertinents et, sur cette base, l’identification tentative des polyphénols présents dans les échantillons.
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L’analyse HPLC-PDA-ESI/MSn d’AePF a révélé la présence de procyanidines et de flavonoïdes comme composés les plus pertinents de cette fraction. Des acides phénoliques ont été identifiés, à savoir l’acide p-coumarique et l’acide ellagique, comme décrit précédemment. De nombreux flavonoïdes ont été caractérisés à la fois par les détecteurs PDA et MS. L’isovitexine, l’hypéroside, l’isoquercitrine, le tiliroside et d’autres dérivés de flavones et de flavonols ont été trouvés dans cette plante. À notre connaissance, la vitexine, le quercétine O-galloyl-hexoside et le kaempférol O-acétyl-hexosyl-rhamnoside ont été trouvés dans cette espèce pour la première fois. Fait intéressant, des activités antiradicalaires et/ou anti-inflammatoires ont été rapportées pour ces trois flavonoïdes.
3.2. Activité antioxydante
Comme le montre le Tableau 2, l’infusion d’Agrimonia eupatoria (AeI) et sa fraction d’acétate d’éthyle (AePF) ont exercé un effet de piégeage significatif, en réagissant avec le radical libre DPPH. AePF était l’échantillon le plus puissant avec une EC50 de 4,60 μg/mL, suivi d’AeI avec une valeur d’EC50 de 12,80 μg/mL.
L’activité de piégeage de l’anion superoxyde a été observée pour deux échantillons, le plus actif étant AePF, qui a mis en évidence une EC50 de 3,34 μg/mL. AeI a présenté une EC50 plus élevée, 13,59 μg/mL (Tableau 2).
AePF était l’échantillon le plus puissant concernant l’effet de piégeage du radical hydroxyle, montrant une EC50 de 90,97 μg/mL. AeI a montré une valeur d’EC50 de 126,99 μg/mL (Tableau 2).
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Concernant la bioactivité antioxydante, nos résultats ont démontré qu’AePF était plus active contre le DPPH, le superoxyde et le radical hydroxyle que l’infusion. Par conséquent, l’extraction à l’acétate d’éthyle s’est révélée être une technique efficace pour extraire les composés qui confèrent des propriétés antioxydantes à l’infusion d’Agrimonia eupatoria. En fait, les effets d’AePF sur le DPPH et l’anion superoxyde étaient, respectivement, similaires à ceux du BHT, un antioxydant synthétique, et supérieurs à ceux de la quercétine, un puissant antioxydant naturel. Ces résultats sont conformes aux données décrites précédemment pour le kaempférol, la quercétine et le tiliroside, présentant d’importantes activités de piégeage du DPPH et du superoxyde. D’autre part, des activités plus faibles contre le radical hydroxyle ont été observées, corroborant ce qui est cité dans la littérature.
3.3. Essais in vitro
L’effet cytotoxique d’AeI et d’AePF sur les macrophages RAW 264.7 a été rapporté au pourcentage de lipopolysaccharide (LPS), montrant que seules les concentrations les plus élevées testées pour AeI (770 μg/mL) et AePF (276 μg/mL) diminuent la viabilité cellulaire (Figure 2(a)).
L’effet sur la production de NO a été analysé en mesurant l’accumulation de nitrite dans le milieu de culture de macrophages stimulés par le LPS. Comme le montre la Figure 2(b), l’incubation des macrophages avec le LPS, pendant 24 h, a entraîné une augmentation significative de la production de nitrite par rapport au témoin. En tenant compte de la toxicité d’AeI et d’AePF pour les concentrations 770 μg/mL et 276 μg/mL, respectivement, qui a été discutée dans la section précédente, l’inhibition de la production de NO n’a été considérée que pour les concentrations non toxiques des échantillons. Par conséquent, AeI et AePF, pour des concentrations de 382 μg/mL et 138 μg/mL, ont réduit la production de NO relativement au LPS sans effets délétères sur les cellules (11,34% et 22,46% d’inhibition, respectivement).
Seuls les échantillons qui n’ont pas affecté la viabilité cellulaire dans l’essai MTT ont été testés dans la méthode SNAP utilisée pour évaluer la capacité de piégeage du NO des échantillons. Pour les concentrations testées, AeI et AePF ont toutes deux diminué les niveaux de nitrites dans le milieu de culture (Figure 2(c)). AeI a montré une inhibition significative de l’activité SNAP de 36,67%, à une concentration de 382 μg/mL. AePF a diminué les niveaux de nitrites dans une plus grande mesure, avec une inhibition de 29,46%, à une concentration de 138 μg/mL.
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L’oxyde nitrique est un médiateur pro-inflammatoire impliqué dans les maladies liées à l’inflammation. Par conséquent, une diminution des niveaux d’oxyde nitrique est une stratégie importante pour améliorer l’inflammation. AeI et AePF ont toutes deux légèrement diminué les niveaux d’oxyde nitrique in vitro. Dans l’essai SNAP, les deux échantillons (AeI et AePF) ont montré des propriétés de piégeage du NO sans différences statistiquement significatives entre leurs doses équivalentes. Cela suggère que le mécanisme derrière la réduction des niveaux de nitrite observée dans la culture de macrophages peut être dû à l’effet de piégeage du NO des composés présents dans AeI et AePF.
3.4. Essais in vivo
3.4.1. Activité anti-inflammatoire
L’œdème de la patte induit par la carraghénane a été significativement réduit 4 h après l’administration des échantillons. L’infusion a réduit l’œdème de 43,2% (AeID1) et 52,2% (AeID2) et la fraction enrichie en polyphénols l’a réduit de 34,6% (AePFD1) et 35,4% (AePFD2) (Figure 3).
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3.4.2. Activité analgésique centrale
Les résultats révèlent que les souris traitées avec les deux doses d’aigremoine n’ont montré aucune augmentation significative du temps de réaction au contact de la plaque chauffante (Figure 4). En fait, à AeID2, le temps de réaction moyen (±SEM) était de 5,84 (±0,50) et à AeID3 il était de 6,20 (±0,77). Pour AePFD2, le temps de réaction moyen (±SEM) était de 5,17 (±1,18) et à AePFD3 il était de 4,16 (±0,49). Les souris traitées par la morphine ont montré une augmentation marquée du temps de réaction à 23,05 (±2,72).
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3.4.3. Activité analgésique périphérique
Les résultats présentés dans la Figure 5 montrent que l’aigremoine produit une inhibition des contorsions abdominales induites par l’acide acétique chez la souris. Le médicament de référence a induit une inhibition de 71,3%. Les souris traitées avec AeID2 et AeID3 ont montré une réduction de 43,5% et 49,8% du nombre moyen de constrictions abdominales, respectivement, tandis qu’avec AePFD2 et AePFD3, la réduction était, respectivement, de 29,2% et 46,8%.
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3.4.4. Activité analgésique
Dans le test à la formaline, seule la dose AePFD3 a été testée. Elle n’a montré aucun effet pertinent dans la phase précoce de la réponse douloureuse mais a induit une réduction de 32,5% du temps passé à lécher dans la phase tardive (Tableau 3).
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Les tissus hépatiques et rénaux des animaux traités avec les échantillons n’ont pas montré de différences résultant d’effets toxiques, comparativement aux animaux du groupe témoin (Figure 6).
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Dans les modèles expérimentaux utilisés dans les essais in vivo, les échantillons ont présenté un effet significatif pour la réduction de l’œdème de la patte de rat induit par la carraghénane. Dans ce cas également, il n’y a pas de différences significatives entre les doses équivalentes d’AeI et d’AePF. Cela est conforme aux résultats ci-dessus pour l’essai SNAP. En outre, bien qu’il existe une tendance à une réduction des valeurs d’inflammation avec l’augmentation de la dose d’AeI, il n’y a pas de différences statistiquement significatives entre AeID1 et AeID2 ni entre AePFD1 et AePFD2. Cela peut suggérer que, pour les concentrations testées, l’activité anti-inflammatoire des composés a déjà atteint son plateau maximal. Cette hypothèse est soutenue par le fait que les doses utilisées ont été calculées sur la base de celles parmi les plus élevées mentionnées en médecine traditionnelle.
Le diclofénac sodique est un anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) courant, bien connu pour ses activités anti-inflammatoires et analgésiques. Comme l’aigremoine a présenté la capacité d’inhiber le gonflement de la patte de l’animal, cela suggère que son effet anti-inflammatoire pourrait être lié à l’inhibition de la synthèse et de la libération de divers médiateurs inflammatoires et à son activité antioxydante et à ses propriétés de piégeage des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote, agissant éventuellement comme inhibiteur de l’action des leucocytes polymorphonucléaires, inhibant ainsi la libération d’oxygène et d’azote réactifs.
Une capacité significative de piégeage de l’anion superoxyde et du NO a été détectée pour AeI et pour AePF. Cette activité antioxydante pourrait être responsable des propriétés anti-inflammatoires d’Agrimonia eupatoria. L’anion superoxyde est un médiateur inflammatoire et il réagit avec le NO en donnant naissance au peroxynitrite, qui est un puissant oxydant également impliqué dans les processus inflammatoires. Ce médiateur inflammatoire agit par différentes voies : inhibition de la libération de cytokines et de la formation de peroxynitrite et inhibition de l’infiltration des neutrophiles. Par conséquent, l’activité significative de piégeage de l’anion superoxyde observée peut également contribuer à l’activité anti-inflammatoire observée dans les essais in vitro et in vivo.
Le modèle de contorsions induites par l’acide acétique induit la libération de médiateurs endogènes tels que l’histamine, la sérotonine, la bradykinine, l’acétylcholine, la substance P et les prostaglandines, qui sont impliqués à la fois dans les mécanismes pro-inflammatoires et de douleur périphérique. Ce modèle de douleur est donc sensible à l’action des AINS. Pour Agrimonia eupatoria, les résultats suggèrent des propriétés analgésiques par des mécanismes périphériques. Ce fait est probablement dû au potentiel anti-inflammatoire de l’aigremoine. Comme ces deux processus physiologiques partagent de nombreux médiateurs et mécanismes moléculaires, dans certains cas, leur inhibition est concomitante. En réalité, ce type de mécanisme anti-inflammatoire a déjà été décrit chez une autre espèce du même genre, Agrimonia pilosa.
Concernant l’analgésie centrale, l’infusion et la fraction d’aigremoine n’ont montré aucune activité antinociceptive, n’augmentant pas le temps de réaction des animaux sur la plaque chauffante. Cela soutient l’hypothèse ci-dessus d’un mécanisme partagé entre les effets analgésiques et anti-inflammatoires.
Dans le test à la formaline, l’injection de formaline induit une réaction douloureuse biphasique chez la souris, les phases précoce et tardive. Les résultats sont quantifiés comme le temps que les animaux passent à lécher la patte. L’absence d’effet antinociceptif d’AeI et d’AePF dans la phase précoce corrobore les données ci-dessus, suggérant que leurs propriétés analgésiques ne sont pas liées à une modulation du système nerveux central. D’autre part, la réduction du temps passé à lécher dans la phase tardive soutient l’analgésie par des mécanismes périphériques.
Le processus de fractionnement à l’acétate d’éthyle nous a permis d’obtenir une fraction avec une concentration plus élevée de polyphénols. Le fait qu’il n’y ait pas de différences significatives entre les effets anti-inflammatoires et analgésiques d’AeI et d’AePF lors de la comparaison de leurs doses équivalentes, c’est-à-dire des doses avec la même concentration des composés communs à AeI et AePF, suggère que les principaux composés responsables de ces activités sont probablement les polyphénols de cette fraction.
Il n’y a pas de signes de toxicité dans les tissus du foie ou des reins, lorsque l’on compare les images histopathologiques des tissus obtenus chez les animaux témoins avec celles des animaux traités avec l’infusion et sa fraction. Bien que d’autres études sur ce sujet soient nécessaires, ces données suggèrent une absence d’effets toxiques systémiques des échantillons à des concentrations ayant un potentiel thérapeutique.
4. Conclusions
Des activités antioxydantes, anti-inflammatoires et analgésiques périphériques ont été observées pour l’infusion d’Agrimonia eupatoria et/ou sa fraction enrichie en polyphénols à des doses non toxiques pour le foie et les reins. La fraction enrichie en polyphénols, essentiellement constituée de procyanidines et de flavonoïdes, à savoir des dérivés de quercétine, de kaempférol, d’apigénine et de lutéoline, était très active pour tous les essais réalisés, conduisant à la conclusion que les polyphénols ont un rôle très important dans ces propriétés d’Agrimonia eupatoria.
Les résultats du présent travail corroborent l’utilisation traditionnelle de l’infusion d’Agrimonia eupatoria comme antioxydant et anti-inflammatoire et suggèrent que ses polyphénols contribuent à cette activité, ce qui pourrait être utile pour développer de nouveaux agents antioxydants, anti-inflammatoires et/ou analgésiques périphériques bénéfiques. En outre, l’isoquercétine, le tiliroside et le kaempférol O-acétyl-hexosyl-O-rhamnoside devraient être considérés comme des molécules chefs de file pour concevoir de nouveaux pharmacophores, à appliquer au traitement des pathologies liées à l’oxydation et à l’inflammation.