Effets antioxydants et protecteurs du glycoconjugué polyphénolique de l’herbe d’Agrimonia eupatoria L. dans la prévention de l’inflammation dans les cellules humaines
Référence : Journal of Functional Biomaterials 2023. — PMC10142550 / PMID 37103272 · DOI 10.3390/jfb14040182 Type : etude in vitro · Plante : Aigremoine eupatoire · Propriété → Anti-inflammatoire Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Nous présentons ici des études structurales et biologiques d’un biopolymère complexe (glycoconjugué polyphénolique) isolé à partir des parties florifères d’Agrimonia eupatoria L. (AE). Les analyses spectroscopiques (UV–Vis et RMN 1H) du composant aglycone de l’AE ont confirmé qu’il se compose principalement de structures aromatiques et aliphatiques caractéristiques des polyphénols. L’AE a montré une activité significative d’élimination des radicaux libres, c’est-à-dire ABTS+ et DPPH·, et a été un agent réducteur efficace du cuivre dans le test CUPRAC, prouvant finalement que l’AE est un puissant antioxydant. L’AE n’était pas toxique pour les cellules humaines d’adénocarcinome pulmonaire (A549) et les fibroblastes de souris (L929), et n’était pas génotoxique pour les souches bactériennes S. typhimurium TA98 et TA100. De plus, l’AE n’a pas induit la libération de cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 (IL-6) et le facteur de nécrose tumorale (TNF-α) par les cellules endothéliales de veine pulmonaire humaine (HPVE-26) ni par les cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC). Ces observations étaient corrélées avec la faible activation du facteur de transcription NF-κB dans ces cellules, lequel joue un rôle important dans la régulation de l’expression des gènes responsables de la synthèse des médiateurs inflammatoires. Les propriétés de l’AE décrites ici suggèrent qu’il pourrait être utile pour protéger les cellules contre les conséquences défavorables du stress oxydatif et pourrait présenter un intérêt comme biomatériau pour la fonctionnalisation de surface.
1. Introduction
Les polyphénols sont bien connus pour leurs nombreuses activités biologiques précieuses, telles que le piégeage des radicaux libres, et leur activité antioxydante est considérée comme l’une de leurs principales propriétés favorables à la santé. Par conséquent, on estime que les polyphénols protègent les organismes vivants contre le stress oxydatif en réduisant l’activité des espèces réactives de l’oxygène (ROS). La perturbation de l’équilibre entre la production et la destruction des ROS entraîne une augmentation incontrôlée de leur concentration. Cela peut conduire au stress oxydatif, responsable de lésions directes de biomacromolécules importantes, c’est-à-dire les lipides, les acides nucléiques et les protéines. Le stress oxydatif prolongé contribue à l’apparition de nombreuses maladies dans la société, notamment les complications cardiovasculaires et les troubles néoplasiques. Même un stress oxydatif modéré provoque l’activation plaquettaire, entraînant une formation incontrôlée de caillots sanguins ainsi que la libération de divers médiateurs inflammatoires, notamment des cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine 6 (IL-6) et le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α). Par conséquent, l’apport quotidien de polyphénols réduit indirectement, mais très efficacement, le risque de nombreux problèmes de santé. Les propriétés des composés polyphénoliques qui sont précieuses pour la santé humaine comprennent la capacité de leurs groupes hydroxyle à former des liaisons hydrogène avec de nombreuses autres molécules, par exemple avec les protons des noyaux aromatiques présents dans les structures des protéines, ce qui réduit l’activité d’enzymes impliquées dans la production de ROS telles que le cytochrome P450, la cyclooxygénase, la lipoxygénase ou la xanthine oxydase. De plus, les polyphénols ont la capacité de chélater et d’éliminer les ions métalliques responsables de la formation de radicaux libres. Parmi les autres propriétés bien identifiées des polyphénols, leur activité anti-inflammatoire résulte principalement de leur capacité à inhiber la biosynthèse de facteurs qui provoquent l’inflammation et l’activation plaquettaire, ce qui entraîne l’agrégation plaquettaire. Plus précisément, ces facteurs sont les prostaglandines, les prostacyclines, les anions superoxyde, l’oxyde nitrique, les leucotriènes et les isoprostanoïdes.
Des rapports scientifiques ont indiqué que les produits végétaux obtenus à partir des parties aériennes d’Agrimonia eupatoria L. possèdent un grand potentiel pharmaceutique et biologique, y compris l’activité anticoagulante in vitro récemment révélée, en raison des conjugués de polysaccharides de type pectine avec des matrices polyphénoliques macromoléculaires. D’autres polyphénols de petite molécule bien décrits chez A. eupatoria, notamment les flavonoïdes, les acides phénoliques, les coumarines, les tanins et les terpénoïdes, ont démontré des effets bénéfiques pour la santé principalement en raison de leurs propriétés bien connues de piégeage des radicaux libres. Les études bibliographiques ont montré que les tissus d’A. eupatoria sont particulièrement riches en divers glycosides flavonoïdes, tels que la lutéoline, l’acacétine, l’apigénine, la quercétine, le kaempférol, le kaempféride et la rutine, en plus de certains flavonols, c’est-à-dire la catéchine, l’épicatéchine et ses polymères, la myricétine et l’isorhamnétine, et d’acides phénoliques, c’est-à-dire les acides p-coumarique, vanillique, gentisique, p-hydroxybenzoïque et hydroxycinnamique. Indépendamment des bénéfices attendus de nombreux polyphénols végétaux, certains peuvent être cytotoxiques et, par conséquent, perturber le fonctionnement des organes internes, notamment le foie, les reins, le cœur et le système respiratoire, et même endommager la structure de l’ADN. Il est donc essentiel de vérifier qu’un composé végétal doté de propriétés bénéfiques est sûr pour un usage interne.
À la lumière de l’état actuel des connaissances sur les polyphénols, en particulier ceux issus d’A. eupatoria, et sur leurs propriétés biologiques intéressantes, nous avons décidé d’étudier l’effet de modulation des cytokines ainsi que les activités antimutagènes et antioxydantes in vitro de glycoconjugués polyphénoliques isolés à partir des parties florifères de cette plante médicinale. La recherche présentée est une continuation d’études antérieures sur les propriétés du biopolymère complexe d’A. eupatoria (AE). Par conséquent, nous nous sommes concentrés sur les activités qui pourraient découler du composant polyphénolique du conjugué. Nous avons caractérisé la capacité du complexe polyphénol–polysaccharide à éliminer les radicaux libres à la fois par transfert d’atome d’hydrogène (HAT) et par transfert monoélectronique (SET), car le mécanisme d’action des antioxydants d’origine végétale n’est pas entièrement compris. En outre, l’activité du produit AE dans des lignées cellulaires et des souches cellulaires bactériennes a été examinée afin d’évaluer ses éventuels effets cytotoxiques et mutagènes. De plus, une série d’expériences in vitro a évalué le rôle de l’AE comme stimulant du système du facteur nucléaire κB (NF-κB) dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et les cellules endothéliales de veine pulmonaire humaine.
2. Matériels et méthodes
2.1. Matériel végétal et réactifs
Les parties florifères d’A. eupatoria L. ont été achetées sur le marché local en Pologne. L’identité de la plante a été certifiée par la professeure Krystyna Kromer de l’Université de Wrocław (Wrocław, Pologne), et un spécimen témoin d’herbier (no 005054) a été déposé au Jardin botanique de l’Université de Wrocław (Wrocław, Pologne). Les milieux RPMI-1640, Hank’s et F12 ont été achetés auprès de Biowest (Nuaillé, France). Le sérum de veau fœtal (FCS) a été obtenu auprès de HyClone (Pittsburgh, PA, États-Unis). Le kit de test BD OptEIA a été acheté auprès de BD Biosciences Pharmingen (San Jose, CA, États-Unis). Le liquide lymphocytaire SMF 1077 (1,077 g/mL) a été obtenu auprès de CytoGen (Łódź, Pologne). L’anticorps monoclonal primaire anti-NF-κB p-65 a été acheté auprès de Chemicon International Inc. (Billerica, MA, États-Unis). L’anticorps secondaire biotinylé, le peroxyde d’hydroxyde (30 %) et un kit de substrat liquide diaminobenzidine (DAB) pour peroxydase ont été achetés auprès de Novocastra Laboratories Ltd. (Newcastle upon Tyne, Royaume-Uni). Le réactif 3,3′,5,5′-tétraméthylbenzidine (TMB) et le bleu trypan (0,4 %) ont été achetés auprès de Serva Electrophoresis GmbH (Heidelberg, Allemagne). Le tampon phosphate salin (PBS) a été préparé à l’Institut d’immunologie et de thérapie expérimentale (Wrocław, Pologne). L’hématoxyline, le réactif Novostain Super ABC et le test Ames MPF 98/100 ont été achetés auprès d’Endotell AG (Alschwill, Suisse). En outre, la L-glutamine, les solutions de pénicilline et de streptomycine, le pyruvate de sodium, le 2-mercaptoéthanol, le cyclolino peptide A (CLA), le lipopolysaccharide (LPS) d’E. coli (0111:B4, L-4130), le supplément de croissance des cellules endothéliales (ECGS), le nicotinamide adénine dinucléotide réduit par hydroxyde de sodium (NADH), l’acide 2,2-azinobis(3-éthylbenzothiazoline)-6-sulfonique (ABTS), le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH), la néocuproïne, l’acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique (Trolox, TR), le paraformaldéhyde, le diméthylsulfoxyde (DMSO) et le tampon Tris ont été achetés auprès de Sigma–Aldrich (Poznań, Pologne). L’hydroxyde de tétraméthylammonium (TMAH), les sels inorganiques et les solvants organiques de pureté analytique ont été obtenus auprès d’Avantor Performance Materials (Gliwice, Pologne). Le substrat DAB a été préparé à l’aide du kit de substrat liquide DAB pour peroxydase comme suit : 4 gouttes de DAB liquide à 0,1 % ont été dissoutes dans un tampon Tris 0,1 M et mélangées avec 2 gouttes de H2O2 à 0,02 % ; ensuite, le mélange a été dilué dans 5 mL d’eau distillée.
2.2. Lignées cellulaires
La lignée cellulaire humaine d’adénocarcinome pulmonaire A549 (ATCC CCL 185) et la lignée cellulaire de fibroblastes de souris L929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line ATCC CCL1) provenaient de la collection de lignées cellulaires de l’Institut d’immunologie et de thérapie expérimentale (Wrocław, Pologne). Les cellules L929 et A549 ont été cultivées dans du milieu RPMI-1640 contenant 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 10 % de FCS. Les cellules endothéliales de veine pulmonaire humaine (HPVE-26, ATCC CRL-2607) ont été obtenues auprès de l’American Type Culture Collection (Manassas, VA, États-Unis). Les cellules HPVE-26 ont été cultivées dans du milieu F12 contenant 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 10 % de FCS et 0,03 mg/mL d’ECGS (Sigma–Aldrich, Saint Louis, MO, États-Unis).
2.3. Isolement et caractérisation du biopolymère complexe
Le processus d’isolement du biopolymère complexe à partir de l’herbe d’A. eupatoria L. (AE, Mw~55 × 103 g/mol) a été réalisé selon une procédure en plusieurs étapes décrite précédemment. Brièvement, les parties séchées et broyées du matériel végétal ont été hachées et extraites deux fois avec de l’hexane pour dégraissage (4 h, 69 °C). Ensuite, le matériel végétal a été macéré dans NaOH 0,1 M (24 h, température ambiante (TA)), puis extrait avec NaOH 0,1 M (4 h, 97 °C). Par la suite, l’extrait recueilli a été filtré et centrifugé (15 min, TA, 1850× g) et neutralisé, puis le solvant a été évaporé. L’extrait obtenu a été dissous dans de l’eau distillée et extrait deux fois avec de l’éther diéthylique (4 h, 34 °C). Ensuite, la fraction organique a été éliminée et l’extrait aqueux a été concentré. L’extrait pâteux a été mis en suspension dans du méthanol (24 h, TA), et le résidu insoluble dans l’alcool (AIR) a été filtré puis séché. Le produit sec obtenu a été dissous dans de l’eau distillée et dialysé (MWCO 12,5–14,0 × 103 Da) contre de l’eau distillée (96 h, TA). Enfin, la fraction macromoléculaire a été obtenue et évaporée sous pression réduite pour donner le glycoconjugué polyphénolique (AE).
Avant l’analyse par RMN 1H, l’AE a été soumis à une hydrolyse acide (acide trifluoroacétique (TFA), 120 °C, 5 h) afin d’obtenir la partie aglycone (AEag). Le spectre RMN 1H de l’AEag a été enregistré dans NaOD à 10 % à TA sur un spectrophotomètre RMN Bruker AMX600 (Rheinstetten, Allemagne). Les déplacements chimiques ont été référencés au TMS comme étalon interne. Le spectre UV–Vis de l’AEag a été enregistré dans une solution alcaline (C = 0,05 mg/mL) dans la plage de longueurs d’onde λ = 200–1000 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques SPECTROstar Nano (BMG Labtech, Ortenberg, Allemagne).
2.4. Essais antioxydants
Trois tests spectrophotométriques différents ont été utilisés pour évaluer la capacité antioxydante totale de l’AE : les essais ABTS, DPPH et CUPRAC. Pour estimer la capacité de l’AE à réduire l’activité oxydante du DPPH●, le produit végétal a été dissous dans une solution aqueuse d’éthanol (v/v, 1:1) afin d’obtenir une série de solutions avec des concentrations comprises entre 2,5 et 1000 µg/mL. En outre, l’activité antioxydante de l’AE (essai ABTS+·) et la capacité de l’AE à réduire les ions Cu(II) dans la néocuproïne (test CUPRAC) ont été évaluées en appliquant des solutions aqueuses d’AE à 0,5–500 µg/mL. Comme l’activité antioxydante de l’AE était supposée se situer dans une gamme similaire à celle des préparations végétales, le TR a été utilisé comme témoin positif. L’activité antioxydante relative de l’AE a été exprimée sous forme de capacité antioxydante équivalente totale (TEAC) ou de concentration nécessaire pour montrer 50 % d’activité antioxydante, ICA50 et ICD50, respectivement.
2.5. Détermination de la toxicité de l’AE
2.5.1. Propagation des lignées cellulaires
L’AE a été dissous dans du milieu RPMI-1640 supplémenté avec 2 % de FCS dans une gamme de concentrations (1,9–1000 µg/mL). La cytotoxicité de l’AE a été déterminée en mesurant la croissance de la lignée cellulaire humaine d’adénocarcinome pulmonaire A549 et de la lignée cellulaire de fibroblastes de souris L929. Les critères de détermination de l’effet toxique étaient fondés sur les modifications de la morphologie cellulaire selon EN ISO10993-5:2009 (« Évaluation biologique. Partie 5 : essai de cytotoxicité in vitro, Organisation internationale de normalisation » 2009). L’évaluation de la cytotoxicité potentielle de l’AE a été réalisée dans des cultures en monocouche de cellules A549 ou L929. À chaque fois, des cellules à une densité de 5 × 104/puits ont été incubées pendant 24 h dans un incubateur de culture cellulaire. Ensuite, le surnageant de culture a été retiré, et une quantité appropriée d’échantillon d’AE dans le milieu de culture a été ajoutée aux cultures cellulaires en monocouche (200 µL/puits), puis incubée à 37 °C dans de l’air à 5 % de CO2 pendant 72 h. La croissance cellulaire, la morphologie et la viabilité (coloration au bleu trypan) ont été déterminées à l’aide de méthodes d’analyse d’image. Le degré de cytotoxicité a été défini comme la concentration la plus élevée d’AE provoquant au moins 50 % de destruction cellulaire.
2.5.2. Évaluation clinique des patients
L’étude a été approuvée par le comité d’éthique (Hôpital spécialisé provincial de Wrocław, Pologne) (approbation no KB/nr6/rok2012) et a été menée conformément à la Déclaration d’Helsinki. Un consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets/volontaires impliqués dans l’étude. Du sang périphérique complet a été prélevé chez des volontaires à l’aide de systèmes de seringues héparinées à la station de don du sang du IVe Hôpital clinique militaire avec polycliniques de Wrocław (Pologne). Les donneurs étaient des hommes en bonne santé âgés de 19 à 23 ans, diagnostiqués exempts d’infections virales et bactériennes, d’inflammation et de maladies allergiques, et n’avaient reçu aucun médicament antiplaquettaire, anticoagulant ou anti-inflammatoire ni aucun antibiotique dans les 14 jours précédant le don de sang.
2.5.3. Isolement des PBMC
Le sang veineux d’un donneur unique a été prélevé dans des seringues héparinées et dilué deux fois avec du PBS. Les PBMC ont été isolées par centrifugation sur SMF 1077 Lymphocyte à 400× g pendant 20 min à 4 °C. Les cellules d’interphase ont ensuite été lavées trois fois avec le milieu de Hank’s et remises en suspension dans le milieu de culture à une densité de 2 × 106 cellules/mL. Les cellules isolées ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10 % de FCS, des antibiotiques, 1 mM de pyruvate de sodium et du 2-mercaptoéthanol, puis incubées dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C, 5 % de CO2.
2.5.4. Activation de NF-κB dans les PBMC
Les PBMC ont été distribuées dans des plaques 96 puits à fond plat en aliquotes de 100 µL (2 × 105 cellules/puits). Le LPS d’E. coli (O111:B4) a été ajouté à une concentration de 5 µg/mL. L’AE a été testé aux concentrations suivantes : 10, 50 et 100 µg/mL. Le niveau d’activation de NF-κB dans les cellules a été déterminé par coloration immunocytochimique.
2.5.5. Induction des cytokines dans le sang total humain
Le sang total humain a été dilué 10 fois avec du milieu RPMI-1640 et distribué dans des plaques de culture 24 puits en aliquotes de 1 mL. Les cultures ont été stimulées avec du LPS (5 µg/mL), et l’AE a été ajouté aux concentrations de 1,25, 2,5 et 5,0 µg/mL. Après incubation pendant la nuit, les surnageants ont été recueillis et congelés à −80 °C jusqu’à la détermination des cytokines. Le TNF-α et l’IL-6 dans les surnageants ont été déterminés par dosages immunoenzymatiques (ELISA) selon le protocole fourni avec le kit.
2.5.6. Induction des cytokines dans la lignée cellulaire HPVE-26
L’AE a été ajouté à une culture de cellules HPVE-26 de 24 h à une concentration finale de 10, 50 ou 100 µg/mL. Comme témoin négatif, le milieu de culture a été appliqué. Les cultures cellulaires ont été stimulées avec du LPS (5 µg/mL). Après incubation pendant la nuit à 37 °C sous 5 % de CO2, les surnageants ont été recueillis et congelés à −80 °C jusqu’à la détermination des cytokines. Les niveaux de TNF-α et d’IL-6 dans les surnageants ont été déterminés par dosages immunoenzymatiques (ELISA) selon le protocole fourni, et le niveau d’activation de NF-κB dans les cellules a été déterminé par coloration immunocytochimique.
2.5.7. Dosage des cytokines
Les niveaux de cytokines ont été déterminés dans les surnageants à l’aide de kits ELISA pour le TNF-α humain et l’IL-6 selon les instructions du fabricant. La densité optique a été mesurée à λ = 450 nm à l’aide d’un lecteur spectrophotométrique Multiskan RC (Thermo Labsystems, Waltham, MA, États-Unis).
2.5.8. Coloration immunocytochimique pour NF-κB
Une méthode immunocytochimique bien établie pour évaluer l’activation du système NF-κB dans les PBMC et les cellules HPVE-26 a été appliquée. Les cellules ont été placées sur des lames de microscope revêtues de poly-L-lysine par cytocentrifugation (Cytospin 4, Thermo Shandon, Cheshire, Royaume-Uni) (5 min à 500 rpm). Les cellules ont été fixées à TA à l’aide d’une solution de paraformaldéhyde à 4 % et séchées à l’air. Après lavage à l’eau distillée, l’activité peroxydase endogène a été bloquée par incubation des lames dans une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % dans le méthanol pendant 5 min et lavage avec du PBS 10 mM (pH = 7,5). Les préparations Cytospin ont été traitées avec un sérum bloquant universel pendant 20 min à TA. Par la suite, les cellules ont été incubées à TA pendant 60 min supplémentaires dans une chambre humide avec un anticorps IgG polyclonal de lapin anti-NF-κB (sous-unité p-65). Après lavage avec du PBS, les préparations ont été incubées avec un anticorps secondaire anti-lapin biotinylé à TA pendant 30 min. Cela a été suivi d’un lavage avec du PBS et de l’application d’avidine conjuguée à la peroxydase dans une chambre humide à TA pendant 30 min. Après lavage avec du PBS, le chromogène DAB rapide a été utilisé pendant 2–10 min. Ensuite, les préparations ont été contre-colorées dans l’hématoxyline, lavées une dernière fois à l’eau distillée et montées sur milieu. Deux observateurs indépendants en aveugle ont quantifié la coloration cytoplasmique ou nucléaire dans les cellules (100 cellules ont été comptées sur chaque lame). Les PBMC et cellules HPVE-26 exprimant p-65 dans le noyau ont été désignées comme cellules NF-κB (+). L’activation du système NF-κB dans les PBMC et les cellules HPVE-26 a été exprimée en pourcentage de cellules NF-κB (+) parmi toutes les cellules quantifiées. L’activation de NF-κB a été évaluée à l’aide d’un microscope Nikon type 120 (Tokyo, Japon) avec canal vidéo et logiciel informatique approprié. Le pourcentage de cellules avec noyaux colorés reflétait le degré d’activation des cellules étudiées (100 cellules ont été comptées sur chaque lame avec 3 observations indépendantes).
2.6. Test de mutagénicité d’Ames
Les études de mutagénicité de l’AE ont été réalisées dans un modèle in vitro au moyen du test en microplaque Ames MPF 98/100 (Xenometrix, Endotell) utilisant les souches Salmonella typhimurium TA98 et TA100. Brièvement, 10 μL de chaque échantillon d’AE préalablement dissous dans du DMSO dans la gamme de concentrations de 15,6–500 µg/mL ont été mélangés avec 240 μL de suspension bactérienne dans un milieu d’exposition (avec ou sans activation métabolique obtenue par la fraction S9 de foie de rat induite par l’Aroclor 1254 (mélange à 4 %)) dans des plaques 24 puits, et le mélange a été incubé (90 min, 37 °C) sous agitation. Ensuite, 2,8 mL de milieu contenant un indicateur de pH ont été ajoutés à chaque puits avant agitation, puis 50 μL de chaque mélange ont été transférés dans un milieu de croissance et incubés (48 h, 37 °C) sous agitation. Enfin, les puits avec colonies visibles ou ceux où la couleur du mélange passait au violet en raison de l’acidification du milieu due à la production de CO2 par les bactéries au cours du processus métabolique ont été comptés ; ces puits étaient supposés contenir le révertant. Enfin, les puits avec colonies visibles de S. typhimurium ou avec un changement visible de couleur vers le pourpre ont été comptés et identifiés comme contenant le révertant his+. La concentration d’AE était considérée comme mutagène lorsqu’elle provoquait une augmentation d’au moins trois fois du nombre de révertants par rapport au témoin négatif. Pour mesurer la mutation inverse spontanée, le DMSO a été utilisé comme témoin négatif, tandis que plusieurs mutagènes (2-nitrofluorénone (2-NF) pour TA98, 4-nitrochinoline-N-oxyde (4-NQ) pour TA100 et 2-aminoanthracène (2-AA) pour TA98S et TA100S) ont été utilisés comme témoins positifs.
2.7. Analyse statistique
L’évaluation statistique a été réalisée avec le logiciel Statistica (13.1, TIBCO Software, Palo Alto, CA, États-Unis). Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± E.T. d’au moins 5 expériences répétées. Les différences significatives entre les groupes traités et le témoin ont été déterminées par ANOVA à un facteur, des tests post hoc HSD de Tukey ont été utilisés pour examiner les différences statistiques entre plus de deux groupes, et le test t de Student a été utilisé pour deux groupes. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
3. Résultats et discussion
3.1. Isolement et caractérisation structurale de l’AE
Le biopolymère complexe dérivé d’A. eupatoria (AE) a été obtenu sous forme d’un précipité rouge cramoisi foncé soluble dans l’eau. Comme rapporté précédemment, l’analyse par chromatographie de perméation sur gel (GPC) a révélé que le complexe AE est de nature macromoléculaire (Mw = 55 × 103 g/mol) et se compose d’une partie polysaccharidique et d’un aglycone (AEag), qui est une matrice de type lignine. L’hydrolyse acide dans du TFA 2 M a montré que l’AEag représente approximativement 48,4 % du produit total (w/w). D’après l’analyse antérieure de pyrolyse-méthylation du composant aglycone de l’AE, il a été rapporté que la matrice polyphénolique est composée principalement de sous-unités diméthoxyphényles. Le spectre UV–Vis de l’AEag (A) présentait deux signaux discrets à λ~210 nm, caractéristique des groupes hydroxyle des structures phénoliques. En outre, une large bande dans la plage de longueurs d’onde λ = 265–320 nm, typique des résidus hydroxyle ainsi que carboxyle ou carbonyle présents dans les composés aromatiques, a été observée.
Le spectre RMN 1H de l’AEag (B) a révélé certains protons associés aux carbones des noyaux aromatiques, y compris ceux situés près des substituants hydroxyle dans les structures phénoliques, tels que les pics dans la plage de δ ~ 7,2–6,7 ppm et des signaux légèrement moins intenses avec des déplacements de δ ~ 6,4 ppm et δ ~ 6,0–5,8 ppm, qui, en combinaison, ont confirmé la nature polyphénolique de la portion aglycone de l’AE. Cependant, l’absence de pics dans la plage de δ ~ 5,5–4,5 ppm, caractéristiques des protons associés aux atomes de carbone anomériques des glucides, indiquait l’absence de fractions saccharidiques dans l’échantillon analysé. De même, le spectre RMN 1H montrait également un groupe de signaux dans la plage de δ ~ 1,6–1,3 ppm indiquant la présence de fragments aliphatiques –CH2–, un pic assez intense à environ δ ~ 2,7 ppm caractéristique des protons des groupes –COCH3, et un petit multiplet à δ ~ 0,6–0,4 ppm provenant des protons –CH3. Ces éléments structuraux sont typiquement présents dans les réseaux polyphénoliques. En résumant les analyses chimiques présentées et nos résultats précédents, seules des substances à caractéristiques phénoliques et glucidiques ont été identifiées dans l’AE, à l’exception d’une petite quantité de protéines (~1 %).
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3.2. Activité antioxydante de l’AE
Le composant polyphénolique de l’AE est une molécule structurellement diverse et peut donc contenir à la fois des éléments hydrophobes et hydrophiles. Par conséquent, pour évaluer la capacité totale de l’AE à piéger directement les radicaux libres, des tests généralement utilisés pour l’évaluation de l’activité antioxydante des substances hydrophobes et hydrophiles ont été appliqués. L’activité antioxydante relative de l’AE a été calculée sous forme d’équivalents TR et est exprimée comme TEAC (TEACTR = 1) (D) et comme valeurs ICA50 et ICD50, qui représentent la concentration de l’échantillon analysé à laquelle 50 % de l’ABTS●+ et du DPPH● ont été neutralisés, respectivement. Les résultats ont été évalués au moyen de diverses équations polynomiales et calculés à partir des courbes étalons préparées pour le TR et l’AE, qui caractérisaient la dépendance non linéaire de l’IC à la substance d’essai à une concentration donnée. La capacité de l’AE à neutraliser la forme cationique des radicaux ABTS a donné une valeur TEACAAE50 de 0,65 et une valeur ICAAE50 de 200 µg/mL, tandis qu’avec le TR, l’activité était légèrement inférieure (ICATR50 = 129 µg/mL) (A). La neutralisation des radicaux DPPH par l’AE (B) a donné une valeur TEACD = 0,17, ce qui signifiait que ICDAE50 = 24,5 µg/mL, tandis que la valeur ICDTR50 était de 4,2 µg/mL. Dans le test CUPRAC, la réduction par l’AE de Cu2+ en Cu+ suggérait une activité de piégeage des radicaux libres encore plus forte, puisque TEACCAE n’était inférieure que de 25 % à TEACCTR (C). Les résultats de l’activité antioxydante de l’AE, évalués selon trois méthodes différentes, sont statistiquement significatifs (valeur de p < 0,05). Cette conclusion a été confirmée par une ANOVA à un facteur et des tests post hoc HSD de Tukey.
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La forte activité de l’AE pour éliminer ABTS●+ et sa capacité à réduire le cuivre suggèrent que cette préparation végétale pourrait être un antioxydant efficace impliquant à la fois HAT et SET ; ainsi, l’AE peut réduire efficacement le risque lié aux radicaux libres nocifs. Le composant polysaccharidique du produit végétal contribue probablement aux propriétés réductrices de l’AE, car il se compose principalement d’arabinogalactane lié à du rhamnogalacturonane fortement estérifié. De plus, l’AE présente une bonne solubilité dans un milieu aqueux et une forte activité de piégeage des radicaux libres à des valeurs de pH neutres proches du pH physiologique ; on peut donc supposer que l’AE pourrait être efficace dans les systèmes vivants. L’effet manifestement plus faible de piégeage du DPPH● par l’AE peut être dû à plusieurs facteurs : (i) l’encombrement stérique lorsque les noyaux phényles du DPPH● empêchent le don efficace de protons des groupes hydroxyle phénoliques macromoléculaires de l’AE aux électrons non appariés présents sur l’azote dans la structure radicalaire ; et (ii) le milieu réactionnel était une solution alcool-eau au lieu d’alcool pur en raison de l’insolubilité de l’AE dans les solvants organiques. Les résultats du présent travail concernant la capacité de piégeage des radicaux (RSC) de l’AE sont en accord avec des études antérieures sur des extraits aqueux bruts de l’herbe d’A. eupatoria. La valeur RSC DPPH● des extraits bruts était approximativement de 0,3, et celle pour ABTS●+ était au moins deux fois plus élevée. Cependant, l’AE neutralisait les radicaux libres plus efficacement que les extraits bruts d’A. eupatoria en raison de la grande pureté de l’AE.
3.3. Détermination de la toxicité de l’AE
La cytotoxicité de l’AE a été déterminée en mesurant la croissance de la lignée cellulaire épithéliale humaine A549 et de la lignée cellulaire de fibroblastes de souris L929. Les critères de détermination de l’effet toxique étaient fondés sur les changements de morphologie cellulaire selon EN ISO10993-5:2009. La méthode implique l’utilisation de deux types de cellules — cellules saines et cellules cancéreuses. L’activité métabolique des lignées cellulaires a été évaluée en utilisant l’AE à des concentrations allant de 1,9 à 1000 µg/mL. Les résultats ont montré que le produit d’A. eupatoria était généralement non toxique jusqu’à 500 µg/mL. Un effet toxique de l’AE n’a été observé qu’à une concentration de 1000 µg/mL. La concentration la plus faible d’AE toxique pour environ 50 % des cellules a été exprimée sous forme de TCCD50. Les cultures cellulaires incubées avec l’AE ont été évaluées toutes les 24 h à l’aide d’une analyse d’image. Les cellules présentaient une forme et une taille normales, similaires à celles traitées avec le milieu de culture (CM). Un effet toxique du produit végétal a été constaté à une concentration de 1000 µg/mL, caractérisé par un changement de morphologie cellulaire, la présence de granules dans le cytoplasme et la mort cellulaire subséquente.
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Des études sur le potentiel mutagène et génotoxique du produit d’A. eupatoria ont été réalisées au moyen du test d’Ames à des doses vérifiées comme non cytotoxiques pour les lignées cellulaires A549 et L929, c’est-à-dire des concentrations d’AE dans la plage de 15,6–500 µg/mL. Les expériences ont été réalisées avec deux souches bactériennes pour détecter directement les points de mutation : S. typhimurium TA98 pour lire les changements du décalage du cadre de lecture de l’ADN et S. typhimurium TA100 pour détecter les substitutions anormales de paires de bases dans la chaîne d’ADN. Les cellules bactériennes n’ont pas été activées avant les expériences. Par conséquent, les mesures n’ont été effectuées que pour les cellules subissant une expression spontanée (témoin négatif), une expression cellulaire induite par l’AE ou les cellules avec activation métabolique (TA98S et TA100S). Le génome des bactéries dépendantes de l’histidine (his+) a été délibérément privé de la capacité de synthétiser l’histidine afin de réduire leur taux de survie dans un milieu de culture sans acides aminés. Au cours des expériences, les souches ont été inoculées dans un milieu contenant des traces d’histidine suffisantes pour seulement plusieurs divisions cellulaires. La présence de cellules bactériennes dans ces conditions signifie que le défaut génétique ayant entraîné l’incapacité de produire l’histidine bactérienne a été réparé par mutation inverse. En outre, la fraction microsomale S9 a été introduite dans le milieu de culture afin de simuler les conditions biochimiques des mammifères. Le test d’Ames sans fraction S9 permettait la détection de mutagènes directs, tandis que le test avec fraction S9 permettait la détection de mutagènes indirects. Les bactéries ont également été traitées avec des mutagènes connus comme témoins positifs, c’est-à-dire 2-NF, 4-NQ ou 2-AA, afin de vérifier leur sensibilité génotoxique. Les résultats obtenus avec et sans activation métabolique ont indiqué que le produit AE n’était mutagène à aucune des doses testées en relation avec les génomes de S. typhimurium TA98 et S. typhimurium TA100. Le produit d’A. eupatoria, à toutes les concentrations testées, n’a pas induit de mutation inverse, puisque le nombre de cellules mesuré était similaire, voire inférieur, à celui du témoin négatif. En outre, toutes les doses testées d’AE n’ont pas provoqué d’augmentation concentration-dépendante du nombre de révertants. Les différences entre les résultats des tests d’Ames n’ont pas atteint la significativité statistique (valeur de p < 0,05). Ces données nous ont permis de conclure que le produit végétal ne contenait pas de mutagènes directs provoquant des mutations par décalage de phase de lecture et substitution de paires de bases dans l’ADN bactérien, détectables par les souches d’essai utilisées. Pukalskiene et al. et Santos et al. ont rapporté que les extraits aqueux bruts de l’herbe d’A. eupatoria étaient non toxiques et non mutagènes envers des lignées cellulaires saines, et même à des doses plutôt élevées (C = 382 μg/mL), une viabilité cellulaire de près de 100 % était observée. Les études de cytotoxicité, mutagénicité et génotoxicité in vitro ont prouvé que l’AE est potentiellement sûr et pourrait être recommandé pour des expériences dans un modèle in vivo.
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3.4. Effet de l’AE sur la réponse immunitaire dans la lignée cellulaire HPVE-26 et dans le sang total in vitro
L’objectif de cette recherche était d’évaluer l’effet direct du produit AE sur la sécrétion des cytokines TNF-α et IL-6 par les cellules endothéliales de veine pulmonaire humaine (cellules HPVE-26) et la culture de sang total in vitro, ainsi que de déterminer l’activation nucléaire de NF-κB dans les cellules HPVE-26 et les PBMC. Les cytokines pro-inflammatoires sont des produits des réactions inflammatoires dans l’organisme, et l’expression de ces protéines est contrôlée par des facteurs de transcription régulateurs, y compris NF-κB. En outre, NF-κB est connu comme critique dans la régulation des molécules pro-inflammatoires au cours des réponses cellulaires, en particulier l’expression de cytokines, c’est-à-dire l’interleukine-1β (IL-1β), le TNF-α, l’interleukine-8 (IL-8), l’IL-6 et l’interféron-β (IFN-β). Dans la plupart des cellules eucaryotes, la voie de transduction du signal NF-κB s’est révélée responsable de la régulation de nombreux processus biochimiques et réponses immunologiques. L’activation de NF-κB est considérée comme un événement initial important dans la réponse inflammatoire à divers stimuli, notamment les agents infectieux, les toxines, les cytokines, les facteurs de croissance, le stress oxydatif et les changements des conditions physiques. Après stimulation cellulaire, l’information provenant de l’environnement externe est transduite vers l’intérieur de la cellule, et l’expression des gènes est activée. L’activation de NF-κB est un processus en plusieurs étapes qui consiste en la phosphorylation, l’ubiquitinoylation et la dégradation des sous-unités inhibitrices connectées au dimère fonctionnel des protéines NF-κB. Les protéines NF-κB sont présentes dans le cytoplasme sous une forme inactive combinée à leur inhibiteur IκB. Lorsque l’IκB phosphorylé se dissocie du complexe NF-κB-IκB, cela entraîne la translocation de NF-κB du cytoplasme vers le noyau. Les molécules IκB subissent une dégradation sous l’influence d’une kinase appropriée, permettant la translocation de NF-κB du cytoplasme vers le noyau, sa liaison avec une séquence génique appropriée, l’activation de la transcription et la production de cytokines pro-inflammatoires. Les nombreux gènes impliqués dans la réponse inflammatoire sont régulés par l’activité de NF-κB (Gilmore Lab Publications » NF-KB Transcription Factors|Boston University, n.d.). NF-κB est fortement activé aux sites d’inflammation dans diverses maladies, telles que la sclérose en plaques, les maladies inflammatoires de l’intestin, le psoriasis et l’asthme.
Les résultats présentés ici ont montré que l’AE ne stimulait pas les cellules humaines HPVE-26 à produire des quantités plus élevées de TNF-α et d’IL-6, tandis que le LPS (endotoxine) provoquait la libération de ces cytokines en grandes quantités. La stimulation des cellules humaines HPVE-26 par le LPS a augmenté la concentration de TNF-α de 26,7 pg/mL à 121,0 pg/mL et la concentration d’IL-6 de 7,39 à 404,91 pg/mL (A). Cependant, la corrélation entre les niveaux de NF-κB activé et les quantités de TNF-α sécrétées par les cellules humaines HPVE-26, en présence d’une série de concentrations d’AE, était statistiquement significative. De même, dans la culture de sang total in vitro, l’AE n’a pas induit d’augmentation des quantités des deux cytokines analysées, mais le LPS a provoqué une augmentation de la production de TNF-α de 14,7 à 2156,9 pg/mL. Le niveau d’IL-6 dans la culture de sang total a également augmenté de 3,6 pg/mL à 3142,3 pg/mL, après stimulation par le LPS (C). Les résultats de l’analyse des quantités de TNF-α et des concentrations de cytokines pro-inflammatoires obtenues dans les échantillons de sang total humain, en présence d’AE, indépendamment de sa concentration testée, n’ont pas atteint la significativité statistique entre les groupes examinés (valeur F = 0,593321), ce qui a été confirmé dans le test post hoc HSD de Tukey.
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En outre, aucune différence significative d’expression de NF-κB n’a été observée dans les cellules HPVE-26 ou dans les PBMC de sujets sains après induction par diverses concentrations d’AE par rapport au groupe témoin (A,B). Dans les PBMC obtenues de sujets sains et les cellules HPVE-26, la stimulation par le LPS (5 µg/mL) a augmenté l’activation de NF-κB, comme en témoigne la translocation de p-65 vers le noyau. Les pourcentages de NF-κB (+) dans les PBMC ou les cellules HPVE-26 après stimulation témoin sans LPS par rapport à la stimulation avec LPS ont augmenté de 8,6 % à 23,1 % dans les PBMC et de 3,8 % à 13,7 % dans les cellules HPVE-26. Après stimulation par le LPS des cellules sanguines de donneurs sains et des cellules HPVE-26, l’activation de NF-κB a été détectée à des niveaux observés dans diverses maladies. Les auteurs d’études précédentes ont démontré que les polyphénols activent des hétérodimères de la voie des facteurs apparentés à NF-E2/élément de réponse antioxydant, qui, à leur tour, peuvent modifier l’activité de NF-κB. Cette observation suggérait que l’AE était capable de réduire l’expression des ARNm de cytokines pro-inflammatoires, telles que TNF-α et IL-1β, dans les cellules sanguines exposées au LPS. Hougee et al. ont constaté que les flavonoïdes et divers glycosides, tels que la lutéoline, l’apigénine et d’autres composés isolés de l’herbe d’A. eupatoria, peuvent réduire l’activité transcriptionnelle de NF-κB dans les monocytes et macrophages primaires stimulés par le LPS.
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Diverses études ont démontré le potentiel anti-inflammatoire des espèces d’Agrimonia. Bien que les mécanismes des effets anti-inflammatoires des extraits végétaux n’aient pas encore été entièrement élucidés, des données récentes ont montré que les extraits d’AE sont capables de réduire l’activité de NF-κB par suppression de sa translocation nucléaire.
En résumé, l’observation particulièrement notable de cette étude est que l’AE n’a pas provoqué de réponse inflammatoire significative. En outre, dans la lignée cellulaire HPVE-26, le produit d’A. eupatoria a légèrement réduit le niveau des cytokines pro-inflammatoires et l’activité de NF-κB en dessous du niveau physiologique. Les expériences avec les PBMC ont révélé que l’AE n’induisait pas d’activation de NF-κB au-dessus du niveau d’activation spontanée. En considérant ces résultats comme prometteurs, on peut suggérer que l’AE ne stimule pas les cellules à produire des médiateurs inflammatoires et, à certaines doses, peut même protéger les cellules contre l’inflammation. De plus, Santos et al. ont confirmé un effet anti-inflammatoire des extraits aqueux bruts d’A. eupatoria chez la souris in vivo pour des pathologies liées à l’inflammation.
4. Conclusions
La recherche présentée est une continuation des études structurales et biologiques du biopolymère complexe isolé à partir des parties florifères d’A. eupatoria L. (AE). Les études spectroscopiques (UV–Vis et RMN 1H) du composant aglycone de l’AE ont confirmé ses caractéristiques polyphénoliques. En ce qui concerne ses propriétés biologiques, l’AE a éliminé de façon significative les espèces ABTS·+ et DPPH· et a agi comme un agent réducteur efficace du cuivre dans le test CUPRAC, prouvant finalement ses puissantes propriétés antioxydantes. En outre, l’AE était non toxique pour les cellules humaines d’adénocarcinome pulmonaire A549 et les fibroblastes de souris L929. De plus, l’AE n’était ni génotoxique ni mutagène pour les souches S. typhimurium TA98 et TA100. En outre, les résultats présentés ont montré que l’AE n’induisait pas la libération de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et TNF-α) par les cellules endothéliales de la veine pulmonaire humaine (HPV26) ni par les PBMC humaines, ce qui était corrélé avec la faible activation de NF-κB dans ces cellules.
La capacité protectrice de l’AE à prévenir l’influence négative des radicaux libres grâce à son composant polyphénolique, associée à la non-toxicité et à l’effet anticoagulant de son composant de type pectine, qui augmentent la solubilité de l’AE dans l’environnement physiologique, montre son potentiel pour exercer une fonction hautement souhaitable dans la circulation sanguine, telle que la prévention de nombreux événements indésirables dans le système circulatoire. Les radicaux libres sont une cause fréquente d’inflammation des vaisseaux sanguins et peuvent conduire à des processus thrombotiques incontrôlés. Par conséquent, le produit d’A. eupatoria offre certaines perspectives pour l’avenir, telles que des thérapies prophylactiques et de soutien pour des états inflammatoires d’étiologies diverses, y compris des maladies de société. L’AE peut protéger le corps humain du stress oxydatif et, par conséquent, réduire également le risque de formation d’espèces réactives secondaires de l’oxygène et de l’azote, qui induisent toutes deux de façon excessive diverses réponses cellulaires conduisant finalement à la nécrose cellulaire et même à l’apoptose. Ainsi, l’AE peut être considéré comme un ingrédient fonctionnel pour des applications pharmaceutiques, alimentaires et cosmétiques.