Apoptose et arrêt en G2/M induits par un extrait aqueux d’Allium ursinum (ail des ours) dans une lignée de cellules cancéreuses gastriques AGS
Référence : OncoTargets and Therapy 2013 · PMID 23836991 · DOI 10.2147/OTT.S45865 Type : etude in vitro · Plante : Ail des ours · Propriété → Cancer Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Contexte La présente étude a été conçue pour déterminer si Allium ursinum L (ail des ours) pouvait inhiber la prolifération des cellules cancéreuses gastriques humaines AGS. En outre, nous avons cherché à déterminer si cette inhibition pouvait se produire en ciblant des éléments régulateurs du cycle cellulaire. Méthodes La cytométrie en flux a été utilisée pour observer l’apoptose et le cycle cellulaire dans des lignées cellulaires AGS traitées ou non par un extrait aqueux d’ail des ours. Les protéines liées au cycle cellulaire ont été détectées par Western blot. L’activité des caspases a été mesurée à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique selon les instructions du fabricant. Résultats L’extrait aqueux d’ail des ours a induit l’apoptose et un arrêt en phase G2/M dans les cellules AGS. Le Western blot a montré que la cycline B était inhibée par l’extrait aqueux d’ail des ours. En revanche, les protéines liées à la phase G1 sont restées inchangées après le traitement. Conclusion Nos résultats indiquent que l’ail des ours a efficacement supprimé la prolifération et induit l’apoptose et l’arrêt en G2/M dans les cellules AGS en régulant des éléments du cycle cellulaire.
Introduction
Le cancer gastrique est l’une des tumeurs malignes les plus fréquentes, non seulement en République populaire de Chine mais aussi dans le reste du monde. À l’échelle mondiale, on estime que 989 600 nouveaux cas de cancer de l’estomac et 738 000 décès sont survenus en 2008, représentant 8 % de l’ensemble des cas de cancer et 10 % de l’ensemble des décès.
Il a été démontré que la consommation alimentaire de légumes du genre Allium pourrait réduire le risque de plusieurs types de tumeurs malignes, notamment les cancers de l’estomac, de l’œsophage et de la prostate. La recherche épidémiologique a montré que le risque de cancer de la prostate est significativement plus faible chez les hommes consommant plus de 10 g/jour de légumes du genre Allium que chez les hommes dont l’apport total en légumes du genre Allium est inférieur à 2,2 g/jour.
Allium ursinum L (ail des ours, ail sauvage) est une plante vivace largement répandue dans toute l’Europe. L’ail des ours est utilisé comme épice et comme médecine traditionnelle, abaissant la pression artérielle et étant efficace contre l’artériosclérose, la diarrhée et l’indigestion. Les feuilles d’ail des ours sont utilisées pour traiter les maladies cardiovasculaires depuis le Moyen Âge. Des quantités élevées de composés volatils, tels que les sulfures et les disulfures, qui ont été identifiés dans l’ail des ours, ont un impact direct sur la qualité de l’ail des ours en tant que plante médicinale et en tant qu’épice.
Toutes les parties de la plante d’ail des ours sont connues pour posséder des propriétés antioxydantes, mais les composés chimiques présents dans les feuilles, les tiges et les graines de la plante n’ont pas été entièrement identifiés. À notre connaissance, aucune étude n’a jusqu’à présent examiné les effets de l’ail des ours sur le cancer gastrique. Dans cette étude, nous avons démontré que l’ail des ours prévient significativement la croissance et induit l’apoptose et l’arrêt en G2/M dans les cellules AGS, et nous avons confirmé le mécanisme de l’arrêt en G2/M induit par l’ail des ours.
Méthodes et matériels
Culture cellulaire
Les cellules AGS ont été obtenues auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD, États-Unis) et cultivées dans un milieu RPMI-1640 (HyClone, Logan, UT, États-Unis) complété par 10 % de sérum de veau fœtal et des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine). Les cellules ont été maintenues dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 °C.
Préparation de l’extrait d’ail des ours et spectrophotométrie
Des échantillons en poudre de plantes entières d’ail des ours ont été obtenus auprès de Fei-fei Mou, Shijiazhuang Medical College, Shijiazhuang, République populaire de Chine. Les échantillons en poudre (2 g) ont été extraits avec 50 mL de méthanol acidifié à 1 % d’acide acétique, puis dissous dans de l’eau distillée pour obtenir une solution de travail. En utilisant les méthodes décrites par Putnoky et al, le spectre d’absorption ultraviolette de la solution de travail a été obtenu par rapport à de l’eau distillée dans une cuve en quartz de 1 cm. Le relevé d’absorbance mesuré à 240–250 nm a été lu selon les spécifications de la littérature pour confirmer l’identité du composé absorbant (allicine ; Xian Linhe Biotechnology Co. Ltd Xi’an, République populaire de Chine).
Test de viabilité cellulaire
Les cellules AGS ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à une densité de 1 × 10^3 cellules par puits, 24 heures avant le traitement. Pour le test d’inhibition, les cellules ont été traitées avec différentes concentrations d’ail des ours pendant 48 heures. Ensuite, 20 μL (5 mg/mL) de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT, Sigma-Aldrich, Carlsbad CA, États-Unis) ont été ajoutés à chaque puits et, après incubation à 37 °C pendant quatre heures, la solution de MTT a été retirée et 200 μL de diméthylsulfoxyde à 0,2 % ont été ajoutés pour dissoudre les cristaux. L’absorbance dans chaque puits à 570 nm a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaques (Bio-Rad Hercules, CA, États-Unis). La valeur de CI50 pour l’ail des ours a été déterminée et utilisée dans les expériences ultérieures.
Test d’apoptose cellulaire
L’apoptose a été déterminée à l’aide d’un kit de détection de l’apoptose (KeyGEN, Nankin, République populaire de Chine). Brièvement, les cellules ont été recueillies, lavées deux fois dans une solution tampon phosphate glacée, puis remises en suspension dans un tampon de liaison à une densité de 1 × 10^6 cellules/mL. Les cellules ont été incubées simultanément avec de l’Annexine V marquée à la fluorescéine et de l’iodure de propidium pendant 20 minutes. Le mélange a ensuite été analysé à l’aide d’un cytomètre en flux FACScan (BD Biosciences, Baltimore, MD, États-Unis).
Détection des changements du cycle cellulaire
Les cellules ont été détachées des plaques par trypsinisation et regroupées avec le surnageant de culture cellulaire contenant les cellules non adhérentes. Les cellules ont été lavées une fois avec une solution tampon phosphate, fixées dans de l’éthanol froid à 70 % et conservées à −20 °C jusqu’à l’analyse. Pour la coloration, 1 × 10^6 cellules ont été lavées dans une solution tampon phosphate, puis colorées dans une solution tampon phosphate avec 50 μg/mL d’iodure de propidium (KeyGEN), 200 μg/mL de RNase A et 0,1 % de Triton X-100. Les analyses ont été réalisées à l’aide du cytomètre en flux FACScan.
Dosages par Western blot
Des échantillons d’extrait protéique (pesant chacun 45 μg) ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium et transférés sur des membranes de difluorure de polyvinylidène. Les membranes ont été bloquées avec 5 % (p/v) de lait écrémé dans du tampon phosphate salin additionné de Tween 20, puis sondées avec des anticorps primaires à 4 °C toute la nuit. Les anticorps primaires utilisés étaient la cycline D1, la cycline E, la cycline B et la β-actine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, États-Unis). Après lavage, les membranes ont été incubées avec les anticorps secondaires appropriés pendant deux heures à température ambiante. L’anticorps lié a été détecté à l’aide d’un kit de chimiluminescence améliorée (Amersham Biosciences, Westborough, MA, États-Unis) selon les instructions du fabricant.
Mesure de l’activité des caspases 3, 8 et 9
L’activité des caspases a été mesurée à l’aide d’un kit de dosage colorimétrique selon les instructions du fabricant. Après récolte, les cellules ont été lavées dans une solution tampon phosphate glacée et lysées. Les protéines ont été extraites et conservées à −80 °C jusqu’à utilisation. Ensuite, 20 μL de lysat cellulaire ont été ajoutés à un tampon contenant un substrat conjugué à la p-nitroaniline (pNA) (80 μL) pour la caspase 3 (Ac-DEVD-pNA), la caspase 8 (Ac-IETD-pNA) ou la caspase 9 (LEHD-pNA, KeyGEN). L’incubation a été réalisée à 37 °C sous agitation à 500 tr/min pendant une minute, puis à température ambiante pendant deux heures. La pNA libérée dans chaque puits a été mesurée à l’aide d’un luminomètre lecteur de plaques (Thermo Scientific, Shanghai, République populaire de Chine). Les données ont été recueillies à partir de trois expériences indépendantes.
Analyse statistique
Toutes les données numériques sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type. Les différences entre les valeurs moyennes ont été évaluées à l’aide du test t de Student. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel Statistical Package for the Social Sciences version 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, États-Unis). Les valeurs de P inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.
Résultats
Résultats spectrophotométriques
Le spectre d’absorption ultraviolette de la solution d’ail des ours, obtenu par rapport à de l’eau distillée dans une cuve en quartz de 1 cm, est présenté dans la [ ]. Le profil du spectre d’absorption est significatif dans les zones d’absorption la plus élevée et la plus faible, et des profils distincts indiquent les effets de différentes molécules. En utilisant les valeurs de la littérature pour l’absorption spécifique à 240 nm, la teneur en allicine de l’échantillon brut frais a été trouvée à 0,58 μg/mL.
Effets de l’ail des ours sur les cellules AGS
La viabilité cellulaire a été suivie par essai MTT. La [ ] montre les courbes d’inhibition de la croissance générées. La valeur de CI50 pour l’ail des ours était de 16,2 μM. La prolifération des cellules cancéreuses gastriques AGS a été inhibée par l’ail des ours. Nous avons utilisé une double coloration à l’Annexine V-isothiocyanate de fluorescéine et à l’iodure de propidium pour détecter les cellules apoptotiques. Le taux de cellules apoptotiques a augmenté significativement après le traitement par l’ail des ours. Comme le montre la [ ], le taux de cellules traitées était 3 à 4 fois plus élevé que celui des cellules non traitées ( P < 0,05 ). Nous avons ensuite détecté les changements du cycle cellulaire à l’aide d’une coloration à l’iodure de propidium. Comme le montre la [ ], la proportion de cellules en phase G0/G1 était diminuée dans les cellules traitées par rapport aux cellules non traitées, mais le nombre de cellules en phase G2/M augmentait ( P < 0,05 ). La quantité de cellules en phase G2 après traitement par l’ail des ours était 3 à 3,5 fois plus élevée que celle des cellules non traitées.
Mécanisme de l’apoptose et de l’arrêt en G2/M dans les cellules AGS
Aucun changement des niveaux de cycline D1 ou E n’a été identifié dans les cellules traitées par Western blot ( [ ] ). La principale protéine liée à la phase G2 détectée était la cycline B, qui a presque disparu dans les cellules traitées ( [ ] ). Les résultats étaient cohérents avec les changements du cycle cellulaire rapportés ci-dessus. De plus, l’activité des caspases 3, 8 et 9 était significativement augmentée dans les cellules traitées par rapport aux cellules non traitées ( P < 0,05, [ ] ).
Discussion
Au cours des dernières décennies, une grande partie de l’attention de la recherche s’est portée sur la base moléculaire de la formation et de la transformation oncogéniques. Cependant, la résistance aux médicaments dans le cancer reste un défi lorsqu’on tente de guérir la maladie, et les combinaisons thérapeutiques actuellement utilisées pour traiter le cancer gastrique ne sont pas pleinement efficaces. Il a été rapporté que la plante A. ursinum possède une activité antioxydante, cytostatique et antimicrobienne. Cependant, le mécanisme de l’activité antitumorale de l’ail des ours est resté flou. Dans ce travail, nous avons confirmé que l’ail des ours peut inhiber la prolifération et induire l’apoptose dans les cellules AGS. À notre connaissance, les données disponibles sur l’activité antitumorale de l’ail des ours sont limitées. Cependant, il a été démontré que le disulfure de diallyle, un extrait de l’ail, inhibe la croissance de nombreux cancers. Xiao et al ont rapporté que le trisulfure de diallyle inhibait la viabilité des cellules cancéreuses pulmonaires humaines. En outre, la suppression de la croissance des cellules cancéreuses en association avec un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M et/ou l’induction de l’apoptose médiée par des composés organosoufrés, c’est-à-dire le disulfure de diallyle et le trisulfure de diallyle, a été démontrée dans des cellules cancéreuses humaines du côlon, du neuroblastome et de la prostate. En accord avec des études antérieures, notre recherche a confirmé que l’ail des ours induisait un arrêt en G2/M dans les cellules AGS. Ces résultats indiquent collectivement que les extraits de légumes du genre Allium partagent la caractéristique commune d’une activité antitumorale.
Pour déterminer le(s) mécanisme(s) d’action de l’ail des ours dans les cellules AGS, nous avons identifié les protéines pertinentes pour le cycle cellulaire par Western blot. Il n’y avait aucun changement des niveaux de cycline D1 ou E entre les cellules traitées et non traitées. Les cyclines D1 et E sont des facteurs importants dans la conversion de la phase G1 à la phase G2. Zurlo et al ont également confirmé que la diminution des niveaux de cyclines D1 et E pouvait induire un arrêt de la phase G1 dans les cellules HT-29 de carcinome colique humain. Dans des expériences ultérieures, nous avons constaté que la cycline B, la principale protéine impliquée dans la phase G2, disparaissait lors du traitement par l’ail des ours, ce qui explique pourquoi le cycle cellulaire était bloqué en phase G2. De même, Gao et al ont constaté que la régulation à la baisse de la cycline B par l’aspirine (un donneur d’oxyde nitrique) peut induire un arrêt de la phase G2/M.
Dans l’ensemble, dans nos expériences, nous avons identifié que l’ail des ours avait un effet antitumoral dans les cellules cancéreuses gastriques AGS. L’apoptose et l’arrêt de la phase G2/M ont été observés dans les cellules après traitement par l’ail des ours. Notre recherche offre un éclairage nouveau sur le traitement du cancer gastrique. Dans de futures études, nous prévoyons d’observer plus avant les effets de l’ail des ours sur le cancer gastrique.