Propriétés antioxydantes, antimicrobiennes et antitumorales d’extraits riches en flavonols de feuilles d’Allium ursinum (ail des ours) : comparaison des techniques de macération conventionnelle et d’extraction assistée par ultrasons
Référence : International Journal of Molecular Sciences 2024. — PMID 39684509 · DOI 10.3390/ijms252312799 Type : etude in vitro · Plante : Ail des ours · Propriété → Cancer Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Malgré l’intérêt croissant pour l’utilisation de composés naturels dans la prévention et le traitement des maladies, l’Allium ursinum (ail des ours), connu pour ses propriétés thérapeutiques, n’a pas été largement étudié pour sa composition chimique et ses activités biologiques. Par conséquent, cette étude vise à explorer les activités antioxydante, antibactérienne et antitumorale in vitro des extraits d’A. ursinum en fonction de leur profil phytochimique fonctionnel, tout en évaluant si l’extraction assistée par ultrasons (UAE) améliore les propriétés bioactives par rapport à la macération conventionnelle (CM). Les deux extraits ont été caractérisés par des méthodes spectrophotométriques et par LC-ESI+-MS. L’activité antioxydante a été évaluée par les dosages CUPRAC et de piégeage du peroxyde d’hydrogène, les propriétés antimicrobiennes par la méthode de diffusion sur disque contre cinq souches pathogènes, et l’activité antitumorale par le test MTT sur quatre lignées cellulaires cancéreuses. Les constituants majeurs des extraits méthanoliques de feuilles étaient des dérivés du kaempférol et l’alliine. La rutine, dérivé de la quercétine, a également été trouvée. La macération assistée par UAE a produit 20 % de composés bioactifs en plus par rapport à la CM seule. L’utilisation de l’UAE dans l’extraction a significativement augmenté les propriétés antioxydantes et antimicrobiennes, en accord avec sa composition chimique. L’activité cytotoxique antitumorale était faible à modérée, quelle que soit la méthode, ce qui s’explique par l’absence de composés hautement cytotoxiques. Les extraits d’ail des ours possédaient de fortes activités antioxydantes et des activités antibactériennes substantielles.
1. Introduction
Dans un passé récent, l’utilisation de composés naturels dans la prévention et le traitement de plusieurs maladies, notamment le cancer et les maladies infectieuses bactériennes, a suscité beaucoup d’attention. Certaines des plus anciennes plantes utilisées intensivement depuis l’Antiquité pour leurs propriétés thérapeutiques sont les plantes appartenant à la famille des Alliaceae. L’ail, les oignons, les poireaux et la ciboulette, tous appartenant à cette famille, sont bien connus pour leurs activités antioxydante, antibactérienne, anticancéreuse, hépatoprotectrice ou cardioprotectrice, la plupart de ces effets biologiques étant liés à leur riche teneur en composés organosoufrés.
Malgré les nombreux bienfaits pour la santé démontrés de cette famille, certains des membres sauvages du genre Allium n’ont pas encore été intensivement étudiés pour leur composition chimique et leurs activités biologiques. L’une de ces plantes peu étudiées est l’Allium ursinum, également connu sous le nom d’ail sauvage, ail des ours ou ail d’éléphant. L’ail des ours est originaire d’Asie et d’Europe, en particulier d’Europe de l’Est, notamment de Roumanie, où il constitue un composant important de l’alimentation au printemps. Contrairement à d’autres espèces appartenant à ce genre, l’ail des ours n’a pas encore été cultivé car il a des exigences contraignantes, en particulier des conditions environnementales très difficiles à reproduire. L’Allium ursinum est également difficile à maintenir par micropropagation en raison de ses exigences spécifiques en matière de sol, de sa croissance lente et de son faible taux de germination. Ainsi, cette espèce n’avait pas suscité beaucoup d’intérêt jusqu’à récemment, et les informations sur sa phytochimie et son activité pharmacologique sont rares.
Sur la base des données limitées disponibles, l’A. ursinum, à l’instar d’autres espèces d’Allium, doit ses activités biologiques aux polyphénols et aux composés soufrés (OSC). Il est intéressant de noter qu’il a été démontré précédemment que l’ail des ours contient environ sept fois plus de composés soufrés actifs que l’ail cultivé. Par conséquent, différents extraits de cette espèce se sont révélés posséder des activités cardioprotectrice, antihypertensive, anticarcinogène, antimicrobienne et antioxydante, conservant la plupart des bienfaits pour la santé de l’ail. Cependant, il a été suggéré que l’activité biologique de l’A. ursinum est plus faible, nécessitant des doses plus élevées pour être efficace. En plus des OSC et des polyphénols, l’ail des ours contient des huiles volatiles, des glycosides stéroïdiens et des fibres alimentaires, qui contribuent également à son activité pharmacologique. Compte tenu de tout cela, il n’est pas surprenant que l’ail des ours suscite un intérêt significatif pour son potentiel dans la prévention et le traitement de diverses maladies.
Cependant, les données de la littérature indiquent que la date de récolte, le sol et la localisation géographique influencent significativement la composition chimique de l’Allium ursinum. De plus, la qualité et la quantité du contenu bioactif peuvent être affectées par la technique d’extraction et le solvant utilisé, affectant ainsi les effets biologiques globaux de l’extrait obtenu. La macération est une méthode d’extraction traditionnelle appréciée pour sa simplicité et son efficacité à produire des extraits de haute qualité, ce qui la rend idéale pour l’analyse d’un large éventail de phytochimiques. En revanche, l’extraction assistée par ultrasons (UAE) est une technique moderne qui améliore l’extraction phytochimique en perturbant les parois cellulaires des plantes et en contournant les limitations liées à la polarité ou au poids moléculaire des composants. Cependant, certaines études suggèrent qu’une puissance ou une fréquence ultrasonique élevée peut produire des radicaux libres, conduisant à la dégradation des polyphénols. À l’inverse, d’autres recherches indiquent que l’UAE peut améliorer la teneur en phénols et l’activité antioxydante, améliorant la biodisponibilité. Par conséquent, le but de cette étude était d’examiner les activités antioxydante, antibactérienne et antitumorale in vitro d’extraits méthanoliques obtenus à partir des feuilles d’A. ursinum issu de la flore spontanée de Roumanie, tout en explorant si l’extraction assistée par ultrasons en combinaison avec la macération (UAE+CM) améliore ses propriétés bioactives par rapport à la macération conventionnelle seule (CM), en accord avec le profil phytochimique de ses formulations.
2. Résultats et discussion
2.1. Les rendements d’extraction des méthodes CM et UAE pour les feuilles d’A. ursinum
Les extraits de feuilles d’A. ursinum ont été obtenus dans du méthanol à 70 %, en partant de 4 g de matériel végétal séché, à l’aide de deux techniques d’extraction alternatives : la macération conventionnelle (CM) et l’extraction assistée par ultrasons suivie de macération (UAE+CM). Le méthanol à 70 % a été sélectionné comme solvant, en raison de sa capacité à extraire une grande variété de phytoconstituants polaires, avec une efficacité supérieure par rapport à d’autres solvants. Le rendement d’extraction pour la méthode CM était de 41,32 %, tandis que l’extrait UAE+CM avait un rendement de 45,82 %. Conformément aux études précédentes, nos résultats montrent que l’inclusion de l’UAE dans l’extraction peut conduire à des quantités plus élevées de composés bioactifs par rapport aux méthodes traditionnelles.
2.2. Caractérisation phytochimique des extraits d’A. ursinum
Les teneurs en phénols totaux (TPC) et en flavonoïdes (TFC) des extraits ont été déterminées par spectrophotométrie. La CM était caractérisée par une TPC de 47,63 mg GAE (équivalent acide gallique)/100 ml et une TFC de 4,68 mg QE (équivalent quercétine)/100 ml. La présence de composés phénoliques, y compris de flavonoïdes, dans les feuilles d’A. ursinum a été précédemment rapportée. De plus, selon Kovarovic et al. (2019), les feuilles d’A. ursinum contiennent une teneur en polyphénols totaux statistiquement significativement plus élevée que les fleurs et les bulbes. L’extrait UAE+CM avait une TPC et une TFC similaires, avec des teneurs de 48,14 mg GAE/100 ml et 4,59 mg QE/100 ml, respectivement. Bien que Gîtin et al. (2012) aient constaté qu’en utilisant l’UAE, le niveau de flavonoïdes était bien plus élevé que le niveau de flavonoïdes obtenu par CM, dans notre étude, les différences entre les deux méthodes d’extraction sont mineures et pourraient indiquer une efficacité similaire dans l’extraction des polyphénols. Cependant, il est important de considérer que ces méthodes de quantification sont encore assez rudimentaires.
Les composés phénoliques et sulfoxydes des deux extraits d’Allium ursinum ont été identifiés à titre provisoire à l’aide de la LC-UV-ESI+-MS et semi-quantifiés à l’aide de courbes étalons (acide gallique — thiosulfinates et rutine — flavonols). Les composés phénoliques et sulfoxydes des deux extraits d’Allium ursinum ont été identifiés à l’aide de la LC-ESI+-MS et quantifiés à l’aide de courbes d’étalonnage standard. Plus précisément, la teneur en alliine a été déterminée à l’aide d’une courbe d’étalonnage de l’acide gallique (R² = 0,9978) sur une plage de concentration de 10–100 µg/ml pour les thiosulfinates, tandis que la teneur en flavonols a été évaluée à l’aide d’une courbe d’étalonnage de la rutine (R² = 0,9981) avec la même plage de concentration. Sur les sept pics majeurs (Figure 1), six pics appartenaient aux flavonols, tandis qu’un pic correspondait au sulfoxyde alliine (pic 1). L’identification provisoire des phénols et des sulfoxydes dans les extraits méthanoliques de feuilles d’A. ursinum, basée sur le temps de rétention, les longueurs d’onde d’absorption maximale et les spectres de masse, est présentée dans le Tableau 1.
L’alliine se trouve en forte concentration dans les plantes d’Allium, et elle est le précurseur de l’allicine qui se forme par l’action de l’enzyme alliinase lors de l’écrasement. L’allicine est connue pour ses propriétés antimicrobiennes et anticancéreuses ; ainsi, la présence d’alliine ajoute une valeur thérapeutique substantielle à l’A. ursinum. On sait que la période de récolte affecte la teneur en alliine, la plus grande quantité se trouvant dans les extraits de feuilles récoltées entre mars et avril. Le traitement de transformation affecte également la teneur en alliine, et il a été rapporté que les feuilles séchées d’ail des ours contiennent 0,7–1,7 % d’alliine, tandis que les feuilles fraîches d’ail des ours en contiennent de plus petites quantités (0,25–1,15 %). Conformément à ces données, dans cette étude, des quantités substantielles d’alliine ont été observées dans les deux extraits obtenus à partir de feuilles d’A. ursinum séchées à l’air qui avaient été récoltées en avril.
Les six flavonols trouvés dans les extraits ont été identifiés à titre provisoire comme kaempférol-glucosyl-glucosyl-rhamnoside (pic 2), kaempférol-diglucoside (pic 3), kaempférol-galactosyl-rhamnoside (pic 4), kaempférol-rutinoside (pic 5), quercétine-rutinoside (pic 6) et kaempférol-glucoside (pic 7). Nos résultats concordent avec d’autres études récentes, où la plupart des principaux composés phénoliques détectés dans les extraits d’A. ursinum étaient des glycosides de kaempférol. Stupar et al. (2022) ont également trouvé des concentrations notables de dérivés du kaempférol allant de 1,97 à 89,19 µg/ml dans des extraits obtenus par extraction à l’eau subcritique. La rutine, dérivé de la quercétine, a été trouvée en quantités significatives dans les deux extraits et a également été précédemment rapportée comme faisant partie du profil biochimique de l’A. ursinum. La recherche indique que les parties de la plante utilisées pour l’extraction influencent significativement les concentrations de flavonols. Par exemple, Oszmiański et al. ont identifié 21 composés phénoliques dans différents organes de l’Allium ursinum. Les dérivés du kaempférol se sont révélés prédominants dans les feuilles par rapport aux graines et aux tiges.
L’alliine, ainsi que les flavonols comme la quercétine et le kaempférol qui ont également de puissants effets antioxydants et antimicrobiens, peuvent produire des effets synergiques qui améliorent le potentiel thérapeutique global de cette plante.
La quantité totale de composés phénoliques dans l’extrait CM était de 12,539 mg/ml (Tableau 1). Parmi eux, les composants majeurs étaient le kaempférol-glucosyl-glucosyl-rhamnoside (29,49 % de tous les composés) et le kaempférol-rutinoside (17,75 % de tous les composés). Outre eux, l’alliine représentait 26,05 % de tous les composés trouvés dans l’extrait. Des résultats similaires ont été obtenus pour l’extrait UAE+CM (Tableau 1) en termes de diversité et de proportion de chaque constituant. Bien que les extraits CM et UAE+CM contiennent tous deux des quantités substantielles des mêmes flavonols et de l’alliine, l’ajout de l’UAE à la méthode d’extraction a entraîné des concentrations environ 20 % plus élevées dans les deux catégories de composés, démontrant à nouveau que la technique UAE extrait des quantités plus élevées de composés bioactifs par rapport à la macération traditionnelle.
2.3. L’activité antioxydante des extraits d’A. ursinum
La détermination de la capacité antioxydante des extraits d’A. ursinum apparaît d’une grande importance, et elle a fait l’objet de diverses études, révélant ses bienfaits potentiels pour la santé et ses applications thérapeutiques. Plusieurs études ont confirmé qu’il existe une corrélation entre les composés phénoliques et organosoufrés et l’activité antioxydante. Par exemple, selon Pavlović et al., les extraits d’A. ursinum possèdent des capacités antioxydantes supérieures à celles d’autres plantes sauvages appartenant au genre Allium, suggérant que son profil phytochimique spécifique contribue significativement à sa capacité antioxydante. De même, Rankovic et al. ont noté que l’extrait méthanolique d’A. ursinum présente des niveaux significativement élevés d’acides phénoliques et de flavonoïdes, corrélés positivement à son activité antioxydante.
De plus, les données de la littérature suggèrent que la capacité antioxydante est influencée par le stade de maturité de la plante au moment de la récolte. Toth et al. (2018) ont constaté que la TPC et l’activité antioxydante dans les feuilles d’ail des ours augmentent avec la maturité. Outre le stade de maturité, la méthode d’extraction appliquée peut affecter substantiellement l’activité antioxydante. Cette observation a été faite par Tomšik et al. (2016) qui ont optimisé les conditions d’extraction afin d’obtenir des rendements maximaux pour chacune des réponses observées suivantes : TPC, TFC et capacité antioxydante. Pour obtenir une activité antioxydante plus élevée, il est essentiel d’augmenter la température et d’abaisser la puissance ultrasonique.
Dans notre étude, l’activité antioxydante a été testée à l’aide de deux méthodes : le CUPRAC et l’activité de piégeage du H2O2. En raison de leurs principes sous-jacents différents, les deux méthodes se complètent et donnent une vision plus holistique du potentiel antioxydant de l’échantillon face à différents stress oxydatifs. Lorsque l’activité antioxydante a été mesurée à l’aide de la méthode CUPRAC, l’extrait UAE possédait une activité réductrice plus élevée (87,07 µM Trolox/ml), mais non significativement différente de la valeur obtenue par CM (85,68 µM Trolox/ml). En revanche, lorsqu’il a été testé à l’aide du dosage de piégeage du H2O2, l’extrait obtenu par UAE avait une activité antioxydante significativement plus forte (37,71 µmol Trolox/L) par rapport à l’extrait CM (22,82 µmol Trolox/L). À notre connaissance, c’est la première fois que la capacité antioxydante d’extraits d’ail des ours est mesurée à l’aide de l’activité de piégeage du H2O2. Ces données concordent avec nos résultats précédents, qui montrent que l’extrait UAE est plus riche en polyphénols (Tableau 1), composés connus pour leurs fortes activités antioxydantes. Bien qu’il soit difficile d’établir un parallèle exact entre la capacité antioxydante de différents extraits d’A. ursinum en raison des variations dans les dosages et les unités de mesure utilisées pour mesurer et exprimer la capacité antioxydante totale d’un échantillon, une étude de Petkova et al. (2021) a rapporté des résultats similaires pour des extraits d’A. ursinum obtenus à partir de fleurs en utilisant le dosage CUPRAC.
2.4. L’activité antimicrobienne des extraits d’A. ursinum
L’activité antimicrobienne des extraits d’A. ursinum contre Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis et Escherichia coli a été évaluée à l’aide de la méthode de diffusion sur disque. Les extraits UAE et CM, à la fois dans le méthanol à 70 % et le DMSO comme véhicules, ont été testés par rapport aux témoins négatifs correspondants. Les extraits dérivés de l’A. ursinum ont démontré une activité antibactérienne contre toutes les souches bactériennes testées par rapport aux solvants véhicules (méthanol à 70 % et DMSO), qui ont montré une inhibition de croissance nulle (Tableau 2). À notre connaissance, c’est la première fois que des extraits d’A. ursinum ont été évalués sur S. mutans et P. gingivalis.
L’activité la plus forte a été enregistrée contre les bactéries à Gram négatif, principalement E. coli et P. gingivalis, avec un DIZ aussi élevé que 17,1 mm et 15,1 mm, respectivement. Dans ces cas, l’activité antimicrobienne des extraits est similaire à celle de la gentamicine, qui a servi de témoin positif. Cela semble contredire les rapports précédents, qui suggèrent que les extraits d’ail des ours sont plus efficaces contre les bactéries à Gram positif que contre les bactéries à Gram négatif, les souches d’E. coli étant moins sensibles qu’E. faecalis ou S. aureus. Cependant, aucune de ces études n’a utilisé la technique UAE pour produire les extraits, ni utilisé le DMSO comme solvant final ; ces deux paramètres influencent fortement les résultats (Tableau 2, Figure 2).
Lorsque le méthanol à 70 % a été utilisé comme solvant dans une procédure d’extraction par macération conventionnelle, nos résultats montrent en effet que l’extrait d’A. ursinum a la plus faible activité antimicrobienne contre E. coli (DIZ = 8,0) par rapport à toutes les souches bactériennes à Gram positif, comme attendu. En revanche, l’utilisation du DMSO comme véhicule, connu pour être un très bon solvant pour les composés bio-organiques à hautes concentrations, ou l’emploi de la méthode UAE, dont il a été montré dans cet article qu’elle extrait des quantités plus élevées de composés bioactifs, a fortement augmenté l’activité antimicrobienne de l’extrait contre E. coli (Tableau 2).
Des schémas similaires ont été observés pour toutes les souches bactériennes à Gram positif utilisées dans cette étude ; l’utilisation du DMSO comme véhicule ou de l’UAE comme méthode d’extraction a significativement augmenté l’activité antimicrobienne observée des extraits (Figure 2). Par conséquent, pour toutes les souches bactériennes, l’extrait DMSO UAE avait l’activité antimicrobienne la plus forte.
La composition biochimique des extraits explique l’activité antimicrobienne enregistrée des extraits, car les dérivés du kaempférol et de la quercétine, ainsi que l’alliine, sont connus pour leurs propriétés antibactériennes. Différents thiosulfinates et composés polyphénoliques sont connus pour générer l’activité antimicrobienne des espèces du genre Allium. Il a été observé qu’il existe de multiples sites, à l’échelle cellulaire, impliqués dans le processus antibactérien complexe déployé. L’acide gallique présente de fortes capacités antibactériennes via la perturbation irrémédiable de la membrane de S. aureus et d’E. coli. Cette activité antimicrobienne est basée sur la localisation des doubles liaisons dans le cycle et la position des groupes fonctionnels carboxyle et hydroxyle. Certaines études ont également validé l’action antimicrobienne du kaempférol et de la catéchine. Ces deux dérivés et l’alliine sont présents dans notre extrait d’A. ursinum, confirmant son activité antimicrobienne. Le potentiel de l’A. ursinum comme agent antibactérien naturel est soutenu par un grand nombre de recherches. Concernant l’activité antibactérienne des extraits d’A. ursinum contre différentes bactéries à Gram positif et à Gram négatif, les recherches antérieures ont produit des résultats contradictoires. Comme mentionné précédemment, cela peut s’expliquer par la méthode d’extraction, l’origine de la plante, la partie de la plante et l’isolement de divers produits chimiques actifs utilisant divers solvants pendant l’extraction. Ainsi, les extraits d’acétone, de chloroforme, d’acétate d’éthyle, de n-butanol et d’eau de fleurs et de feuilles fraîches d’A. ursinum ont été examinés pour leur activité antibactérienne contre une variété de bactéries à Gram positif et à Gram négatif par Ivanova et al. Alors que les extraits d’acétone et de chloroforme contenant des composés organosoufrés ont montré une inhibition de S. aureus à Gram positif, aucun des extraits étudiés n’a démontré d’activité antibactérienne contre E. coli à Gram négatif. Ainsi, en fonction de la technique d’extraction, des types de solvants, de la concentration et des composants bioactifs extraits dans les extraits, les auteurs qui ont examiné l’activité antibactérienne des extraits d’A. ursinum ont observé une activité antimicrobienne variable. La souche bactérienne affecte également l’action antibactérienne. Selon Sapunjieva et al., un extrait à l’éthanol à 70 % d’A. ursinum a des propriétés antibactériennes plus puissantes contre les bactéries à Gram positif (L. monocytogenes et S. aureus) que contre les bactéries à Gram négatif (E. coli et Salmonella enterica). D’autres chercheurs ont examiné l’activité antibactérienne de l’A. ursinum dans des extraits à l’eau, au méthanol et à l’éthanol–eau contre S. aureus, E. coli, B. subtilis, P. mirabilis et S. enteritidis à différentes concentrations. Aucune comparaison significative ne peut être établie car l’extrait méthanolique d’A. ursinum n’a montré aucun potentiel antibactérien, tandis que l’extrait aqueux n’a montré une action antimicrobienne que contre B. subtilis. Dans d’autres études, il a été constaté que l’utilisation de l’extrait au chloroforme produisait l’activité antibactérienne la plus efficace contre les bactéries à Gram positif, tandis que l’activité antimicrobienne des extraits à l’eau et au méthanol ne différait pas significativement. Des méthodes d’extraction appropriées qui maintiennent les propriétés antibactériennes doivent être mises en œuvre pour séparer les molécules d’intérêt en vue de différents usages.
2.5. Activité cytotoxique antitumorale des extraits d’A. ursinum
L’effet cytotoxique in vitro des extraits d’A. ursinum a été évalué contre deux lignées cellulaires de cancer du sein (T47D et MDA-MB-231) et deux lignées cellulaires de cancer colorectal (DLD-1 et HT29) 48 h après administration, à l’aide du test MTT. Les cancers du sein et colorectal sont tous deux connus pour répondre à des facteurs liés au régime alimentaire, suggérant que les aliments pourraient aider à leur prévention. De plus, les composés dérivés de plantes pourraient devenir des thérapies complémentaires précieuses pour le cancer du sein (BC) et le cancer colorectal (CRC). Cependant, la forte hétérogénéité des tumeurs — entre les types de cancer et même au sein d’un même type — contribue à des sensibilités variables aux composés naturels. À notre connaissance, c’est la première fois que des extraits d’ail des ours ont été testés sur des lignées cellulaires de cancer du sein et sur les cellules DLD-1 et HT29.
Bien qu’une diminution dose-dépendante de la viabilité cellulaire ait été observée pour les extraits CM et UAE sur les quatre lignées cellulaires (Figure 3), la cytotoxicité des extraits est plutôt modérée lorsqu’elle est analysée selon les normes pharmacologiques générales. Les valeurs d’IC50 les plus basses, de 658,1 µg/ml et 755,8 µg/ml, ont été obtenues pour l’extrait CM contre les cellules HT29 et DLD-1, respectivement (Figure 3). Toutes les autres valeurs d’IC50 étaient autour de 1 mg/ml ou plus (Figure 3). Bien que les dérivés du kaempférol et l’alliine, les constituants majeurs trouvés dans les extraits d’A. ursinum, possèdent une activité antitumorale et expliquent ainsi ces effets, leur cytotoxicité est connue pour être inférieure à celle d’autres composés apparentés dérivés de plantes, tels que la quercétine ou l’allicine. Alors que les extraits CM semblent donner de meilleurs résultats contre les cellules du cancer colorectal, l’extrait UAE apparaît avoir une activité cytotoxique plus forte contre les cellules du cancer du sein. Cependant, aucune de ces différences n’est statistiquement significative (Figure 3), indiquant que l’ajout d’une étape de sonication supplémentaire à la procédure CM n’apporte aucun bénéfice global lorsque les concentrations testées sont égalisées après extraction.
Très peu de données sont disponibles dans la littérature sur les effets cytotoxiques antitumoraux des extraits d’ail des ours. Des résultats similaires de cytotoxicité antitumorale faible à modérée d’extraits méthanoliques obtenus à partir de feuilles d’A. ursinum ont été précédemment rapportés contre les cellules cancéreuses de mélanome murin B16 et de sarcome XC. Des effets cytotoxiques ont également été démontrés contre les lignées cellulaires d’adénocarcinome cervical humain HeLa et d’adénocarcinome du côlon humain LS174, AGS et les cellules gastriques MKN74. Cependant, les différentes unités utilisées pour exprimer les concentrations des extraits, telles que les pourcentages ou les concentrations molaires, ne permettent pas de comparaison quantitative entre tous ces résultats.
3. Matériels et méthodes
3.1. Matériel végétal et préparation des extraits
Les feuilles d’Allium ursinum ont été collectées en avril 2021 dans la flore spontanée de Baia Mare, en Roumanie. Les feuilles ont été séchées à l’air à température ambiante, à l’obscurité, pendant quatre semaines, puis broyées en poudre à l’aide d’un mortier et d’un pilon. Les feuilles pulvérisées d’ail des ours ont été réparties dans 2 tubes expérimentaux (4 g chacun) et laissées dans du méthanol à 70 % (v/v) à un rapport liquide/solide de 12,5:1 ml/g, pendant 24 h, à l’obscurité, comme étape initiale pour les deux procédures d’extraction employées dans cette étude : la macération conventionnelle (CM) et l’extraction assistée par ultrasons (UAE). Pour l’extrait UAE, l’échantillon a ensuite été soniqué à une puissance ultrasonique fixe de 750 W à 40 °C en trois cycles successifs de 10 min (Sonics Vibra-cell VC750 ; Sonics and Materials Inc., Newtown, CT, États-Unis). Pour les deux extraits, un temps de macération supplémentaire de 24 h, à température ambiante, à l’obscurité, a été appliqué. Les homogénats obtenus ont été centrifugés à 450× g pendant 5 min. Le surnageant a été collecté et filtré sur un filtre Millipore de 0,45 µm (Burlington, MA, États-Unis). Le méthanol a été éliminé à l’aide d’un évaporateur rotatif à 40 °C (Heidolph Laborota 4000 Efficient ; Heidolph Instruments GmbH and CO, Schwabach, Allemagne). Les résidus séchés des deux extraits ont été pesés et utilisés pour préparer les solutions mères à une concentration de 100 mg/ml. Le méthanol à 70 % a été sélectionné comme solvant pour l’analyse biochimique et le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour les expériences de cytotoxicité, et les extraits dans les deux solvants ont été utilisés dans le criblage de l’activité antibactérienne. Avant que les procédures analytiques ne soient réalisées, les extraits ont été filtrés à nouveau sur un filtre d’une taille de pore de 0,22 µm. Le rendement d’extraction a été calculé selon la formule suivante : Rendement d’extraction % = Poids de l’extrait sec (g) / poids de l’échantillon utilisé pour l’extraction (g) × 100.
3.2. Détermination de la teneur totale en polyphénols par la méthode de Folin–Ciocalteu
La teneur en phénols totaux (TPC) a été déterminée par spectrophotométrie à l’aide de la méthode de Folin–Ciocalteu, en utilisant une procédure modifiée par rapport à celle décrite par Singleton et al. en 1999. Peu après l’extraction, les échantillons (10 µl/extrait) ont été mélangés avec le réactif de Folin–Ciocalteu (120 µl) et du Na2CO3 aqueux (7,5 % dans l’eau) (340 µl). Le mélange final a été laissé reposer pendant 60 min à l’obscurité, puis à température ambiante, et la TPC a ensuite été déterminée par colorimétrie à 750 nm. Les résultats ont été exprimés en mg d’équivalent acide gallique (GAE) par 100 ml d’extrait, sur la base d’une courbe étalon pour le GA. Chaque échantillon a été préparé en triplicat.
3.3. Détermination de la teneur totale en flavonoïdes par la méthode à l’AlCl3
La teneur en flavonoïdes totaux (TFC) des extraits méthanoliques obtenus par UAE et CM a été déterminée à l’aide d’une méthode spectrophotométrique basée sur la formation d’un complexe flavonoïde–aluminium, comme décrit par Zhishen. Brièvement, chaque extrait a été mélangé séparément avec du NaNO2 à 5 % (90 µl), de l’AlCl3 (90 µl), du NaOH (600 µl) et de l’eau distillée (720 µl) et l’absorbance de chaque échantillon a été mesurée à 510 nm. Les résultats ont été exprimés en mg d’équivalent quercétine (QE) par 100 ml d’extrait. Chaque expérience a été réalisée en triplicat.
3.4. Identification et quantification des composés polyphénoliques et organosoufrés par LC/ESI+-MS
L’identification des composés phénoliques et organosoufrés a été réalisée par analyse de chromatographie liquide (LC) à l’aide d’un système Agilent 1200 (Chelmsford, MA, États-Unis) équipé d’un système de pompe à distribution binaire LC-20 AT (Prominence), d’un dégazeur DGU-20 A3 (Prominence) et d’un détecteur UV–VIS à barrette de diodes SPD-M20 (DAD) (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, MD, États-Unis). La séparation des composés a été réalisée dans une colonne Eclipse XDB C18 (4 µm, 4,6 × 150 mm). Les phases mobiles étaient constituées du solvant A qui contenait de l’eau bidistillée et 0,1 % d’acide acétique/acétonitrile (99/1) v/v, tandis que le solvant B contenait de l’acétonitrile et 0,1 % d’acide acétique. Le système d’élution en gradient a été programmé comme suit : 0–2 min, isocratique avec 5 % (v/v) d’éluant B ; 2–18 min, gradient linéaire de 5 % à 40 % (v/v) d’éluant B ; 18–20 min, gradient linéaire de 40 % à 90 % (v/v) d’éluant B ; 20–24 min, isocratique à 90 % (v/v) d’éluant B ; 24–25 min, gradient linéaire de 90 % à 5 % (v/v) d’éluant B ; et 25–30 min, isocratique à 5 % (v/v) d’éluant B. Le débit a été fixé à 0,5 ml/min et la température de la colonne a été maintenue à 25 °C. Les chromatogrammes ont été surveillés à 340 nm. L’identification des composés et l’attribution des pics ont été réalisées à l’aide de leur temps de rétention, de l’analyse UV–VIS et des spectres de masse, comparés à des standards commerciaux (acide chlorogénique, acide caféique, quercétine-rutinoside, quercétine-glucoside, acide ellagique et myricétine) et à la littérature publiée précédemment. Pour les mesures par spectrométrie de masse, un spectromètre de masse à quadripôle simple 6110 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, États-Unis) équipé d’une sonde ESI a été utilisé. Les mesures ont été réalisées en mode positif avec une tension de pulvérisation ionique de 3000 V et une température capillaire de 350 °C. Les données ont été collectées en mode balayage complet dans la plage de 280 à 1000 m/z. Pour la quantification des composés, 2 courbes étalons ont été utilisées : l’acide gallique (concentrations entre 10 et 100 µg/ml) pour l’alliine et la rutine (concentrations entre 10 et 100 µg/ml) pour les flavonols.
3.5. Évaluation de l’activité antioxydante par les dosages CUPRAC et de piégeage du peroxyde d’hydrogène
Deux dosages d’activité antioxydante, le dosage de la capacité antioxydante réductrice du cuivre (CUPRAC) et le dosage de piégeage du peroxyde d’hydrogène, ont été utilisés dans cette étude. Le dosage de la capacité antioxydante réductrice de l’ion cuivrique (CUPRAC) est basé sur la réduction du complexe cuivre–néocuproïne par un antioxydant. Brièvement, 1 ml de CuCl2·H2O 1,0 × 10⁻² M et 1 ml de néocuproïne 7,5 × 10⁻³ M dans un tampon urée à pH 7 ont été mélangés avec (1,0 − x) ml de tampon standard pH 8 et (x) ml d’extrait ou de solution antioxydante standard. Le mélange a été laissé reposer à température ambiante pendant exactement 30 min. L’absorbance a été enregistrée à l’aide d’un spectrophotomètre (série JASCO V-630, International Co., Ltd., Tokyo, Japon) à 450 nm contre le blanc. Une courbe étalon a été préparée en utilisant différentes concentrations de Trolox et les résultats ont été exprimés en µmol Trolox/ml.
Le dosage de piégeage du peroxyde d’hydrogène est basé sur la capacité des extraits à piéger le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Brièvement, une solution de peroxyde d’hydrogène (40 mM) a été préparée dans un tampon phosphate (0,1 M pH 7,4). Les extraits (0,6 ml) dans de l’eau distillée ont été ajoutés à la solution tampon phosphate (1 ml). Après une incubation de 10 min, l’absorbance a été déterminée à 230 nm, contre une solution blanche (tampon phosphate sans H2O2). Les résultats ont été exprimés en µmol d’équivalents Trolox par litre d’échantillon (TE µmol/L). Le pourcentage de piégeage du peroxyde d’hydrogène est calculé comme suit : % piégé (H2O2) = [(Ai − At)/Ai] × 100, où Ai est l’absorbance du témoin et At est l’absorbance du test.
3.6. Criblage de l’activité antibactérienne par la méthode de diffusion en puits sur gélose
Pour le bioessai, cinq souches bactériennes pathogènes ont été utilisées, dont trois à Gram positif (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212 et Streptococcus mutans ATCC 25175) et deux à Gram négatif (Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 et Escherichia coli ATCC 25922) (ATCC — American Type Culture Collection, Manassas, VA, États-Unis). Toutes les souches bactériennes ont été cultivées dans des milieux de gélose nutritive en boîtes de Petri, selon les instructions du fabricant.
Le criblage antibactérien in vitro des extraits de plantes a été réalisé à l’aide de la méthode de diffusion sur disque. Après avoir été cultivée pendant 24 h sur un milieu de gélose nutritive, chaque souche bactérienne a été diluée à 0,5 McFarland dans du sérum physiologique stérile. Des écouvillons stériles imbibés de ces suspensions microbiennes ont été utilisés pour inoculer chaque boîte de Petri en l’étalant sur toute la surface du milieu de culture solide (gélose Müeller Hinton-Oxoid). Les boîtes de Petri ont été séchées pendant 20 min à 37 °C et des puits de 5 mm de diamètre ont été creusés dans la gélose à l’aide de pointes de pipette stériles coupées. Les puits ont ensuite été remplis de perles de coton stériles. Chaque perle a été chargée avec 100 µl de chaque extrait (note 1 — extrait CM dans le méthanol à 70 % ; 2 — extrait CM dans le DMSO ; 3 — extrait UAE dans le méthanol à 70 % ; 4 — extrait UAE dans le DMSO) et deux témoins étiquetés M (méthanol à 70 %) et D (DMSO). Des disques de gentamicine 10 mcg (CN10) ont été utilisés comme témoins positifs contre les cinq souches bactériennes. L’incubation a été réalisée pendant 24 h à 37 °C (incubateur Salvis Incuccenter IC400, SalvisLab, Rotkreuz, Suisse). Une règle a été utilisée pour mesurer le diamètre de la zone d’inhibition (DIZ), où un diamètre plus grand indiquait une plus grande sensibilité bactérienne vis-à-vis des substances antibactériennes. Le potentiel d’inhibition (PI) de chaque extrait sur chaque souche bactérienne a été classé en quatre catégories : inhibition forte (+ +, DIZ < 15 mm), inhibition moyenne (+ ±, DIZ = 10–15 mm), inhibition légère (+ −, DIZ < 10 mm) et absence d’inhibition (− −, DIZ = 0 mm). Toutes les expériences ont été réalisées en triplicats biologiques.
3.7. Évaluation de l’activité antitumorale à l’aide du test de cytotoxicité MTT
Deux lignées cellulaires de cancer du sein humain (T47D et MDA-MB-231) et deux lignées cellulaires de carcinome colorectal (DLD-1 et HT29) ont été utilisées dans cette étude. Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées dans du milieu RPMI-1640, additionné de 10 % de PBS, 1 % de pénicilline–streptomycine et 1 % de glutamine. De plus, le milieu de T47D a été additionné de 0,2 % d’insuline. Les lignées cellulaires ont été maintenues dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2, à 37 °C, dans un incubateur de culture cellulaire. Les solutions mères d’extraits d’ail des ours (100 mg/ml) ont été préparées dans du DMSO comme solvant et ensuite diluées avec le milieu de culture. Toutes les lignées cellulaires ont été obtenues auprès de l’European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) et les réactifs de culture cellulaire ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, États-Unis.
Les effets cytotoxiques des deux extraits d’ail des ours sur les quatre lignées cellulaires ont été évalués à l’aide du test au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) selon le protocole du fabricant. Brièvement, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à une densité initiale de 2 × 10⁴ cellules/puits. Après 24 h, le milieu a été remplacé par les deux extraits d’ail des ours en neuf concentrations successives (50, 100, 150, 200, 250, 350, 500, 750 et 1000 µg/ml) dans du milieu frais, chacune en six réplicats techniques. Après une période d’incubation de 48 h à 37 °C dans 5 % de CO2, le surnageant a été retiré et 100 ml de la solution de MTT (1 mg/ml) ont été ajoutés. Après 1 h, la solution de MTT a été retirée, 150 µl de DMSO ont été ajoutés à chaque puits pour solubiliser le formazan formé et l’absorbance a été mesurée par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 570 nm, à l’aide d’un lecteur multimode (Synergy HTX, BioTek, Winooski, VT, États-Unis).
Sur la base des valeurs d’absorbance, la viabilité a été calculée comme la fraction de cellules viables par rapport au témoin non traité. Les valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) sur chaque lignée cellulaire ont été calculées avec le logiciel GraphPad Prism version 7 (GraphPad Software, Inc., Avenida de la Playa, La Jolla, San Diego, CA, États-Unis), en utilisant l’équation de régression non linéaire log(inh) vs réponse normalisée. La signification statistique des différences de potentiel antitumoral entre les deux extraits pour chaque lignée cellulaire a été évaluée à l’aide du test U de Mann–Whitney, sur la base de la viabilité à la concentration à laquelle au moins un extrait atteignait 50 % d’inhibition. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
4. Conclusions
Les extraits d’Allium ursinum présentent des propriétés antioxydantes et antibactériennes significatives, soutenant leur potentiel comme traitements complémentaires des infections microbiennes et des affections associées au stress oxydatif. Cependant, les extraits ne présentent qu’une activité antitumorale faible à modérée in vitro, probablement en raison de l’absence de composés hautement cytotoxiques. Ces résultats mettent en évidence l’A. ursinum comme une source prometteuse de composés bioactifs naturels pour des applications médicales, justifiant une exploration plus approfondie.
Comme anticipé, l’ajout d’une étape de sonication dans la procédure de macération conventionnelle augmente le rendement d’extraction des constituants bioactifs, ce qui, à son tour, améliore à la fois les activités antioxydante et antibactérienne des extraits. Par conséquent, en sélectionnant soigneusement les paramètres d’extraction comme la puissance et la fréquence ultrasoniques, il est possible d’améliorer l’efficacité d’extraction sans dégrader les polyphénols. Cependant, lorsque les concentrations sont égalisées après extraction, aucun bénéfice supplémentaire de la sonication n’est observé en termes d’efficacité lors de l’utilisation.