Une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement de l’hypertension artérielle pulmonaire : le lyophilisat d’Allium ursinum atténue les symptômes de façon comparable au sildénafil
Référence : International Journal of Molecular Sciences 2017 · PMID 28677661. — PMID 28677661 · DOI 10.3390/ijms18071436 Type : etude in vivo · Plante : Ail des ours · Propriété → Circulation & coeur Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
L’insuffisance cardiaque droite — souvent causée par une pression artérielle pulmonaire élevée — est une affection chronique et progressive avec des taux de mortalité particulièrement élevés. Des études récentes et nos résultats actuels suggèrent que des composants de l’ail des ours (Allium ursinum, AU) pourraient jouer un rôle dans la réduction de la pression artérielle, l’inhibition de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE), ainsi que dans l’amélioration de la fonction ventriculaire droite dans des modèles de lapin avec insuffisance cardiaque. Nous émettons l’hypothèse que l’AU pourrait atténuer les dommages cardiovasculaires causés par l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) et présenter une valeur dans le traitement complémentaire des complications de la maladie. Dans la présente investigation, l’HTAP a été induite par une dose unique d’injection de monocrotaline (MCT) chez des rats Sprague-Dawley, et les animaux ont été répartis en 4 groupes de traitement comme suit : I. animaux témoins sains (groupe Témoin) ; II. rats hypertendus pulmonaires (groupe HTAP) ; III. rats hypertendus pulmonaires + traitement quotidien au sildénafil (groupe Sildénafil) ; et IV. rats hypertendus pulmonaires + nourriture enrichie en lyophilisat d’ail des ours (groupe WGLL), pendant 8 semaines. Des mesures échocardiographiques ont été obtenues aux semaines 0 et 8 avec imagerie fondamentale et Doppler. La méthode du cœur isolé travaillant a été utilisée pour déterminer les fonctions cardiaques ex vivo après thoracotomie à la 8e semaine. Des analyses histologiques ont été réalisées sur des échantillons de poumon excisés, et la technique du Western blot a été utilisée pour déterminer l’expression de l’enzyme phosphodiestérase de type 5 (PDE5) dans les tissus myocardique et pulmonaire. Nos données démontrent que la fonction ventriculaire droite mesurée par échocardiographie était détériorée chez les animaux HTAP par rapport aux témoins, ce qui a été contrecarré par le traitement à l’AU. Les mesures du cœur isolé travaillant ont montré un flux aortique élevé dans le groupe WGLL par rapport aux animaux HTAP. L’analyse histologique a révélé une augmentation spectaculaire de l’épaisseur de la paroi médiale des artères pulmonaires prélevées chez les animaux HTAP, mais les artères des animaux des groupes traités au sildénafil et au WGLL ont montré un statut physiologique. Nos résultats suggèrent que les composés bioactifs d’Allium ursinum pourraient avoir des effets bénéfiques dans l’hypertension pulmonaire.
1. Introduction
L’insuffisance cardiaque droite — souvent causée par l’hypertension pulmonaire résultant d’une pression artérielle élevée — est une affection chronique et progressive avec des taux de mortalité particulièrement élevés. L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une dysfonction vasculaire caractérisée par des anomalies des cellules endothéliales et musculaires lisses des vaisseaux pulmonaires. Du fait de ces processus, la résistance vasculaire augmente, ce qui commence rapidement à épuiser les mécanismes compensatoires du ventricule droit. Cette maladaptation conduit finalement à des dommages irréversibles du système cardiovasculaire et à la mort prématurée des patients souffrant de la maladie. L’HTAP représente essentiellement en elle-même une vasculopathie, une entité pathologique chronique et progressive. Cela se reflète dans la classification clinique actuelle basée sur l’étiologie et la physiopathologie de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) des types d’hypertension pulmonaire (HTP), où l’HTAP représente un groupe individuel.
L’affection est majoritairement caractérisée par une résistance vasculaire (RVP) progressivement croissante des artères pulmonaires. Comme le ventricule droit est très sensible aux changements de post-charge, des mécanismes adaptatifs à l’augmentation de la pression — tels que le mécanisme de Frank-Starling et l’hypertrophie du muscle ventriculaire — apparaissent aux stades précoces de la maladie. L’augmentation de la tension dans les cordages tendineux et la dilatation de l’anneau conduisent à une régurgitation tricuspide, entraînant une dilatation de l’oreillette droite, une surcharge volumique du ventricule droit et une diminution du débit cardiaque. Des lésions ischémiques apparaissent également en raison de l’aggravation de l’hypertrophie. Le septum interventriculaire s’amincit et est même poussé vers le côté gauche du cœur, réduisant ainsi le volume du ventricule gauche pendant la diastole. Ces processus aboutissent nécessairement à une diminution du débit cardiaque causée par une réduction anormale de la précharge du ventricule gauche. Ce cercle vicieux se termine par une hypoxie systémique, une insuffisance cardiaque sévère et une mort prématurée.
La première ligne des processus pathologiques sous-jacents de l’HTAP est la vasoconstriction des artères pulmonaires causée par un déséquilibre des médiateurs vasoconstricteurs et vasodilatateurs. De multiples voies de signalisation dérégulées ont été identifiées chez les patients atteints d’HTAP, et une part significative des agents thérapeutiques spécifiques de la maladie influence l’évolution de la maladie par ces voies, à savoir la voie de l’oxyde nitrique (NO) (I), la voie de la prostacycline (II) et la voie de l’endothéline-1 (III).
Les preuves incluent une diminution de l’expression de la NO synthase et des niveaux anormalement élevés d’arginase dans les poumons des patients atteints d’HTAP, ainsi qu’une surexpression de l’enzyme phosphodiestérase de type 5 (PDE5), et donc des niveaux réduits de guanosine monophosphate cyclique (GMPc). D’autres études ont montré des niveaux réduits de prostacycline (PGI2) et d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) dans les tissus concernés, ce qui s’explique en partie par le fait que l’expression de la prostacycline synthase est anormalement basse dans les poumons de ces patients.
L’endothéline-1, agissant sur les récepteurs ETA et ETB, est un médiateur vasoactif aux effets prolifératifs concomitants sur les cellules musculaires lisses de la paroi vasculaire. Dans des conditions physiologiques, lorsque l’endothélium est intact, l’activation des récepteurs ETB augmente la production de NO et de PGI2. Cependant, chez les patients atteints d’HTAP, la voie du récepteur ETA prend le dessus sur ces effets, provoquant une vasoconstriction en augmentant les niveaux de calcium intracellulaire et l’activation de l’enzyme protéine kinase C (PKC), ainsi qu’en induisant la prolifération via la voie MAPK (mitogen-activated protein kinase) dans les cellules musculaires lisses des vaisseaux pulmonaires. Des niveaux élevés d’endothéline-1 ont été identifiés dans les tissus pulmonaires affectés, et le peptide est présent à des concentrations plus élevées chez les patients atteints d’HTAP par rapport aux témoins sains. De plus, une forte corrélation a été trouvée entre les niveaux d’endothéline-1 et le degré d’hypertension pulmonaire.
La première approche thérapeutique moderne, basée sur les faits précédents, consistait à élever les niveaux de GMPc dans le poumon, puisque la vasodilatation requise causée par le NO est médiée par le GMPc en tant que messager secondaire. Comme l’administration thérapeutique d’oxyde nitrique lui-même par inhalation est possible mais très peu pratique, l’élévation du niveau de GMPc est plus réalisable en bloquant sa métabolisation par l’inhibition des enzymes PDE. La phosphodiestérase de type 5 est l’isoforme enzymatique dominante dans le poumon qui convertit le GMPc en guanosine monophosphate (GMP), et ainsi le blocage de cette isoenzyme empêche la dégradation du GMPc et élève ses niveaux intracellulaires. La PDE5 s’est aussi révélée surexprimée dans des échantillons de tissu pulmonaire de patients atteints d’HTAP. Les inhibiteurs de la PDE5 (IPDE5) augmentent l’activité des voies NO-GMPc, et favorisent ainsi la vasodilatation et ont même des effets antiprolifératifs sur les cellules musculaires lisses des vaisseaux pulmonaires. Le citrate de sildénafil, l’ancien IPDE5 phare pour le traitement de la dysfonction érectile, a été approuvé par la FDA (U.S. Food and Drug Administration) pour traiter l’hypertension pulmonaire en 2005. Le sildénafil présente des bénéfices clairs dans l’HTAP ; cependant, la FDA met en garde contre son utilisation à long terme chez les enfants en raison d’un risque accru de mortalité, comme l’a révélé l’essai STARTS-2.
L’ail des ours (Allium ursinum L.), une plante largement répandue en Eurasie et également connue sous le nom d’ail des ours ou buckrams, est un composant alimentaire populaire, une épice et aussi un élément de la médecine traditionnelle. Malheureusement, l’ail des ours, en raison de la similitude des feuilles, peut facilement être confondu avec le Colchicum autumnale, une plante toxique contenant de la colchicine, si bien que certaines études de cas rapportent des empoisonnements rares, mais graves. L’herbe a une odeur d’ail due aux composés soufrés et contient également des niveaux élevés de dérivés polyphénoliques, principalement des glycosides de flavonoïdes. La majorité des propriétés pharmacologiques de l’extrait ou du lyophilisat de la plante sont comparables à celles de son proche parent, l’ail cultivé (Allium sativum) ; cependant, certains effets de l’ail des ours sont supérieurs ou uniques, possiblement en raison de la présence de certains composants spécifiques, tels que des phytostérols et un dérivé de galactolipide (1,2-di-O-α-linolénoyl-3-O-β-d-galactopyranosyl-sn-glycérol). Ce composant semble spécifique à Allium ursinum et peut être absent chez d’autres espèces d’Allium.
Bien qu’une grande quantité de données soit disponible sur les caractéristiques d’A. sativum, les effets thérapeutiques possibles d’A. ursinum sont peu étudiés, et seules quelques publications ont examiné les propriétés pharmacologiques de cette plante. Les effets antiagrégants sur les plaquettes humaines sont bien prouvés, de même que l’inhibition significative in vitro des enzymes 5-lipoxygénase (5-LOX) et cyclooxygénase (COX). Les composants bioactifs de l’ail des ours ont une activité antioxydante et de piégeage des radicaux libres assez élevée, principalement en raison de l’activité de la superoxyde dismutase, de la catalase et de la peroxydase du bulbe et des feuilles. Les extraits d’ail des ours contenant de l’ajoène, du méthyl-ajoène, de l’allicine et du disulfure de diallyle ont également montré une inhibition marquée de la biosynthèse du cholestérol in vitro, de façon équivalente à l’ail cultivé. Les préparations d’Allium ursinum réduisent la pression artérielle et inhibent l’enzyme de conversion de l’angiotensine (ACE) in vivo lorsqu’elles sont testées sur des rats spontanément hypertendus (SHR). La capacité d’inhibition de l’ACE a été démontrée en outre par d’autres études, où l’activité inhibitrice de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (IECA) de l’ail des ours s’est même révélée supérieure à un tel effet de l’ail ordinaire. Les effets antihypertenseurs, hypocholestérolémiants et IECA contribuent à la cardioprotection, et une telle propriété de la plante a été étudiée dans un modèle de rat de lésion d’ischémie/reperfusion. Les cœurs de rats traités par extrait d’ail des ours ont montré une incidence réduite de fibrillation et de tachycardie ventriculaires avec des zones ischémiques diminuées dans les tissus myocardiques. Dans un modèle de lapin d’insuffisance cardiaque induite par l’hypercholestérolémie, notre équipe de recherche a précédemment démontré que la supplémentation en ail des ours améliore la fonction systolique du ventricule droit mesurée par l’excursion systolique du plan de l’anneau tricuspide (TAPSE). De plus, des études suggèrent que les saponines et les flavonoïdes bioactifs d’autres espèces d’Allium (A. chinese, A. cepa) ont des propriétés inhibitrices de l’enzyme phosphodiestérase (PDE 5A). Selon les résultats susmentionnés, nous émettons l’hypothèse que les composants bioactifs d’Allium ursinum pourraient présenter un bénéfice dans le traitement de l’hypertension pulmonaire, en raison d’effets possibles sur le système enzymatique de la phosphodiestérase dans les tissus myocardique et pulmonaire.
2. Résultats
2.1. Spectrométrie de masse
Les ions quasi-moléculaires cationisés par le potassium et le sodium ont été observés. On peut supposer que, sur la base de la masse des pics [M + K]⁺ ou [M + Na]⁺, les composés suivants peuvent être présents dans la plante, comme le montre le Tableau 1 : kaempférol-3-O-rutinoside (à m/z 617,4 [M + Na]⁺ et m/z 633,3 [M + K]⁺) ; quercitrine (à m/z 471,2 [M + Na]⁺ et m/z 487,2 [M + K]⁺) ; juglanine à m/z 441,4 [M + Na]⁺ et m/z 457,3 [M + K]⁺ ; dracorubine (à m/z 511,2 [M + Na]⁺ et m/z 527,2 [M + K]⁺) ; et blumeatine (à m/z 325,2 [M + Na]⁺, m/z 341,2 [M + K]⁺ et m/z 303,1 [M + H]⁺).
Les calculs ont été effectués sur la base de la masse molaire des adduits de K et de Na. La masse molaire exacte de chaque composé a été calculée comme suit : le m/z mesuré moins la masse molaire de l’ion adduit est égal à la masse molaire du composé.
2.2. Échocardiographie
Tous les examens échocardiographiques ont été réalisés dans un intervalle de temps de 20 min, et tous les animaux ont réussi à se remettre de l’anesthésie avec des fréquences cardiaques et respiratoires stables pendant toute la procédure. Comme le montre le Tableau 2, les valeurs de la fraction de raccourcissement (FS) et de la fraction d’éjection (EF) n’ont montré aucun changement entre les groupes. La fonction systolique estimée en mesurant l’excursion systolique du plan de l’anneau mitral (MAPSE) n’a montré aucun changement entre les groupes de traitement, résultat également observé pour la fréquence cardiaque (HR).
L’estimation de la fonction systolique du ventricule droit était réalisable en mesurant les valeurs de TAPSE (excursion systolique du plan de l’anneau tricuspide). Les paramètres de TAPSE des animaux témoins sont restés dans la plage normale (TAPSE Témoin : 2,308 ± 0,074 mm), mais des diminutions significatives ont été trouvées dans les valeurs des animaux du groupe HTAP (TAPSE HTAP : 1,697 ± 0,098 mm) par rapport aux témoins. Les valeurs des animaux traités au WGLL et au sildénafil étaient élevées par rapport au groupe HTAP (TAPSE WGLL : 2,021 ± 0,071 mm, et TAPSE Sildénafil : 2,390 ± 0,069 mm, contre TAPSE HTAP : 1,697 ± 0,098 mm).
La fonction diastolique du ventricule gauche a été estimée à l’aide des techniques Doppler (PW), en déterminant les rapports E/A au niveau de la valve mitrale. Les rapports E/A n’ont été affectés ni par l’injection de monocrotaline, ni par le traitement au sildénafil ou au WGLL après 8 semaines.
2.3. Effets de la monocrotaline (MCT) et des traitements sur la fonction ventriculaire gauche isolée
Les résultats de la fonction VG obtenus par la méthode du cœur isolé travaillant sont présentés dans la Figure 1. Le traitement à la monocrotaline a produit une réduction du flux aortique (AF) par rapport au groupe Témoin (AF HTAP : 27,38 ± 3,447 mL/min contre AF Témoin : 55,33 ± 2,932 mL/min), et le flux aortique des animaux après traitement au WGLL a atteint les valeurs témoins (AF WGLL : 54,36 ± 2,864 mL/min). Le flux coronaire (CF) et la pression aortique (AoP) se sont révélés non affectés par les traitements (p < 0,05). La fréquence cardiaque des cœurs isolés a augmenté chez les animaux traités au WGLL (HR WGLL : 327,5 ± 28,22 bpm) par rapport au groupe Témoin (HR Témoin : 224,0 ± 5,579 bpm).
2.4. Masse corporelle
Nous n’avons observé aucune différence significative de poids corporel entre les groupes, lorsqu’il était mesuré au point final de l’étude (Témoin : 485,5 ± 18,40 g ; HTAP : 502,6 ± 17,79 g ; Sildénafil : 443,9 ± 17,10 g ; et WGLL : 448,2 ± 10,36 g). Une limitation de cette étude est que les effets de la supplémentation en Allium ursinum sur la consommation de nourriture et d’eau n’ont pas été mesurés.
2.5. Morphométrie microscopique
Les examens histologiques des coupes de tissu cardiaque colorées à l’HE de rats sont présentés dans la Figure 2. Les coupes des ventricules droit et gauche (VD + VG) colorées à l’HE ont montré des signes clairs de dommage tissulaire dans tous les groupes traités à la MCT (groupes HTAP, WGLL, Sildénafil), tandis que le groupe Témoin est morphologiquement normal (Figure 2B). Le dommage tissulaire dans les échantillons du groupe HTAP est caractérisé par des contractures des cardiomyocytes, une hyperbasophilie, une hyperéosinophilie, une disposition ondulée des myofibres, un œdème cellulaire, une lésion et une apoptose des cardiomyocytes. Les échantillons du groupe HTAP montrent l’hypertrophie du VD la plus spectaculaire dans la structure myocardique, tandis que seule une hypertrophie macroscopique modérée est visible dans les tissus du VD traités au WGLL par rapport au groupe HTAP. Les échantillons de poumon de tous les animaux ont été évalués par des colorations HE et EVG comme le montre la Figure 2C,D. L’hypertrophie ventriculaire droite (HVD) a été présentée comme le rapport VD/(VG + S), comme le montre la Figure 2E. Le rapport VD/(VG + S) était augmenté dans le groupe HTAP (0,477 ± 0,044) par rapport aux groupes Témoin (0,323 ± 0,020) et WGLL (0,328 ± 0,020). Le pourcentage d’épaisseur de la paroi médiale (% MWT) a été déterminé dans les artères/artérioles pulmonaires (< 50 µm de diamètre) de chaque groupe en utilisant l’équation : % MWT = (M1 + M2)/ED × 100. L’épaisseur de la paroi médiale a augmenté chez les animaux HTAP par rapport à tous les autres groupes (% MWT HTAP : 71,39 ± 2,628 % contre % MWT Témoin : 53,64 ± 3,240 % ; % MWT WGLL : 47,32 ± 2,084 %, et % MWT Sildénafil : 48,91 ± 3,444 %). Nous n’avons observé aucune différence dans les valeurs des animaux traités au WGLL et au sildénafil par rapport au groupe Témoin (Figure 2F).
2.6. Western blot
Les niveaux d’expression de l’enzyme PDE5A dans les tissus ventriculaire droit et pulmonaire sont présentés dans la Figure 3A,B. Lorsqu’elle était mesurée dans les tissus cardiaques, l’expression de la PDE5A dans les groupes HTAP et WGLL était élevée par rapport aux niveaux détectés dans les groupes Sildénafil et Témoin (HTAP : 2,174 ± 0,110 et WGLL : 2,690 ± 0,096 contre Sildénafil : 1,432 ± 0,139 et Témoin : 1,410 ± 0,088). De plus, le traitement au sildénafil a montré une inhibition marquée de l’expression de la PDE5A dans le tissu du VD. Aucun changement n’a été observé dans les valeurs des groupes WGLL et HTAP à partir des homogénats de ventricule droit. En revanche, les niveaux d’expression de la PDE5 dans les tissus pulmonaires traités à la MCT n’ont montré aucune différence par rapport au groupe Témoin ; cependant, une augmentation significative a été observée dans le groupe WGLL par rapport aux animaux du groupe HTAP (Témoin : 1,367 ± 0,189 ; WGLL : 2,329 ± 0,094 ; Sildénafil : 1,968 ± 0,209 contre HTAP : 1,029 ± 0,079 ; en unités arbitraires).
3. Discussion
Une réalisation de la présente étude est la caractérisation de la teneur en flavonoïdes des feuilles d’Allium ursinum, lyophilisées par la méthode utilisée pour nos investigations standard, et sa comparaison aux données disponibles dans la littérature, où les constituants chimiques ont été déterminés à partir de feuilles fraîches. Nos résultats sont bien corrélés aux constatations précédentes, puisque le lyophilisat sec contient plusieurs composés phénoliques, à savoir des dérivés du kaempférol, de la juglanine, de la dracorubine, de la blumeatine et de la quercitrine (comme le montrent la Figure 4 et le Tableau 1) ; ainsi, nous avons démontré avec succès qu’Allium ursinum est exceptionnellement riche en composés flavonoïdes. Ces résultats ont une grande valeur, car si un produit naturel est destiné à être utilisé à des fins thérapeutiques selon la médecine fondée sur les preuves, les chercheurs doivent connaître ses principaux composants et leur structure chimique. En outre, de nombreuses études pharmacologiques ont confirmé le fait que ces polyphénols ont un potentiel élevé dans la prévention et le traitement de plusieurs troubles.
Les données échocardiographiques ont révélé qu’après 8 semaines de traitement, aucune détérioration n’a été observée dans les fonctions diastolique ou systolique du ventricule gauche des animaux hypertendus pulmonaires ou traités au WGLL ou au sildénafil. L’excursion systolique du plan de l’anneau tricuspide (TAPSE) est bien corrélée à la dysfonction ventriculaire droite chez les patients en insuffisance cardiaque, et peut être facilement déterminée en utilisant l’échocardiographie en mode M. Les paramètres de TAPSE étaient réduits chez les rats hypertendus pulmonaires, mais améliorés après 8 semaines de traitement au WGLL. Nos résultats soutiennent les résultats d’autres expériences ; par exemple, Rajkumar et al. ont montré des valeurs de TAPSE très similaires chez des rats atteints d’HTAP induite par la MCT (environ 1,6 mm), ainsi que chez des animaux sains (au-dessus de 2 mm). Selon nos constatations antérieures et récentes, le traitement au lyophilisat d’Allium ursinum améliore la fonction ventriculaire droite chez les lapins hypercholestérolémiques, ainsi que dans un modèle de rat d’hypertension pulmonaire induite par la MCT. Une limitation de cette étude actuelle est que nous n’avons pas réussi à visualiser de façon systématique l’artère pulmonaire et à mesurer des paramètres tels que la pression artérielle pulmonaire, le temps d’accélération et le temps d’éjection pulmonaire par échocardiographie, comme marqueurs de l’HTAP, décrits précédemment par Thibault et al. Notre modèle de maladie a été mis en évidence par d’autres techniques, par exemple en mesurant l’épaisseur de la paroi médiale des artères pulmonaires après coloration histologique.
Le cœur isolé travaillant est une méthode répandue et bien connue pour étudier les fonctions cardiaques sans l’innervation du système nerveux autonome, et notre groupe de travail a réalisé de nombreuses expériences basées sur cette méthode. Les données de l’échocardiographie et du cœur isolé sont souvent bien corrélées pour de nombreux paramètres cardiaques ; cependant, des divergences peuvent aussi être observées, en raison de l’absence d’innervation et de réflexes végétatifs et adaptatifs dans les procédures de cœur isolé travaillant.
Les résultats du cœur isolé de la présente étude (Figure 1) ont révélé que le traitement à la monocrotaline diminue le flux aortique, qui caractérise la fonction de pompe du ventricule gauche. Ce résultat soutient davantage plusieurs constatations antérieures d’autres auteurs, où la monocrotaline a induit une HTAP, et l’insuffisance cardiaque droite consécutive conduit finalement aussi à une insuffisance du ventricule gauche. Selon nos résultats, le sildénafil a augmenté le débit cardiaque par rapport au groupe HTAP. En accord avec cela, de nombreux articles de la littérature scientifique confirment ce résultat et vérifient que le sildénafil exerce une protection significative dans l’HTAP induite par la monocrotaline. De façon comparable, le traitement au WGLL a également exercé une protection contre les changements induits par la monocrotaline : l’Allium ursinum a amélioré le flux aortique et le débit cardiaque par rapport au groupe HTAP. Néanmoins, une augmentation du débit cardiaque a été observée dans le groupe WGLL par rapport au groupe HTAP ; ni la fréquence cardiaque ni les paramètres du volume d’éjection systolique n’ont changé significativement, en raison de la puissance de détection. Malgré les changements non significatifs du flux aortique, les paramètres de débit cardiaque du groupe Sildénafil par rapport au groupe HTAP ont suivi le même schéma. Dans un travail antérieur de notre équipe, le traitement au WGLL a montré des effets similaires sur les paramètres fonctionnels du cœur isolé de lapins hypercholestérolémiques après une lésion d’ischémie/reperfusion.
Des améliorations de la fonction ventriculaire gauche ou droite et du flux aortique après traitement au WGLL ont été montrées sur deux modèles animaux de maladie par notre équipe jusqu’à présent ; cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents, qui semblent être indépendants du système PDE5, nécessitent encore des investigations supplémentaires. Bien que cette étude fournisse des informations de fond utiles sur les effets de la supplémentation en WGLL sur le système PDE, la mesure de l’activité de la NO synthase endothéliale (eNOS) ou des niveaux de GMPc fournirait des éclairages supplémentaires sur les mécanismes potentiels de l’effet protecteur des feuilles d’ail, ce qui sera abordé dans de futures études.
Dans cette étude actuelle, les valeurs de pression aortique n’ont montré aucun changement entre les groupes de traitement. Comme cette méthode utilise un organe isolé, seule l’insuffisance cardiaque ventriculaire gauche la plus sévère pourrait provoquer des changements de pression aortique, c’est-à-dire lorsque le myocarde ne parvient pas à produire une pression suffisante sur le sang dans le ventricule pour le pomper à l’extérieur. Dans notre étude actuelle et nos conditions expérimentales, peut-être en raison de la période de temps relativement courte, l’insuffisance du ventricule gauche n’en était pas à ce stade de développement, et nous n’avons donc observé aucun changement dans ce paramètre.
Les mesures de fréquence cardiaque pendant les expériences de cœur isolé ont montré une augmentation modérée dans tous les groupes traités à la monocrotaline. Une telle augmentation légère de la fréquence cardiaque due au traitement à la monocrotaline a également été montrée par d’autres auteurs.
Dans nos expériences de cœur isolé travaillant, l’Allium ursinum a de nouveau prouvé son efficacité protectrice, de façon comparable au sildénafil dans un modèle de rat d’HTAP : les traitements au sildénafil et au WGLL ont tous deux amélioré les valeurs de débit cardiaque par rapport au groupe traité à la monocrotaline seule. En outre, dans le cas du débit cardiaque, aucun des deux ne différait des valeurs du groupe témoin sain. De même, l’Allium ursinum s’est révélé cardioprotecteur contre d’autres types de lésions différents, tels que la lésion induite par l’ischémie-reperfusion et l’élévation de la pression artérielle ; ainsi, nous considérons l’ail des ours comme un complément potentiellement précieux dans la thérapie de diverses maladies cardiaques.
Bien qu’il ait été rapporté fréquemment que la MCT endommage les cellules endothéliales pulmonaires, les mécanismes toxicologiques exacts par lesquels la MCT initie la toxicité pulmonaire restent obscurs ; en outre, plusieurs chercheurs contestent la pertinence du modèle MCT pour imiter les processus pathobiologiques de la maladie humaine. Malgré ce fait, l’hypertension artérielle pulmonaire induite par la MCT reste le modèle le plus privilégié dans la recherche préclinique pour tester de nouvelles thérapies ; de plus, presque tous les modèles animaux sont imparfaits d’une certaine manière pour imiter le mécanisme pathologique ou la manifestation de cette maladie.
Dans ce travail, nous avons démontré que l’hypertension artérielle pulmonaire induite par la MCT provoquait une hypertrophie du VD dans les modèles animaux, une constatation également publiée dans des études antérieures. Il a aussi été rapporté que le sildénafil atténue la pression artérielle pulmonaire moyenne (PAP), la résistance vasculaire pulmonaire (RVP) et améliore les fonctions du VD en induisant des changements dans l’expression génique des tissus cardiaque et pulmonaire. Nos résultats confirment ces constatations ; en outre, comme rapporté dans les constatations morphométriques microscopiques, la supplémentation en WGLL démontre des effets comparables au sildénafil dans l’atténuation des symptômes de l’hypertension artérielle pulmonaire.
Le remodelage vasculaire pulmonaire est le premier composant, critique, de la pathogenèse de l’HTAP, avec une implication significative du système NO/GMPc. Les isoformes de l’enzyme phosphodiestérase sont responsables de l’hydrolyse du GMPc dans la vasculature pulmonaire. Il a été démontré précédemment que le sildénafil favorise l’accumulation de GMPc, prolongeant ainsi les effets du NO via l’inhibition de l’enzyme PDE5. Cette étude confirme le fait que le sildénafil inhibe l’élévation de l’expression de la PDE5A dans le ventricule droit induite par la maladie, corroborant des rapports antérieurs. Une régulation à la hausse de la PDE5 a été rapportée dans des affections telles que l’insuffisance cardiaque congestive, l’hypertension pulmonaire et même l’hypertrophie ventriculaire droite, peut-être comme mécanisme compensateur. Nos constatations par Western blot vérifient également que dans le modèle d’HTAP induite par la monocrotaline, l’expression de la PDE5A est fortement élevée dans le ventricule droit. Comme le montre la Figure 3A, le traitement au WGLL n’a pas affecté les niveaux élevés de PDE5A dans les tissus myocardiques droits, et exerce possiblement ses effets protecteurs via d’autres voies de signalisation. À notre connaissance, ce résultat est unique, puisqu’aucune autre équipe de recherche n’a étudié l’impact des extraits d’Allium ursinum sur l’expression de l’enzyme PDE5. En outre, les niveaux de PDE5 dans les tissus pulmonaires étaient élevés après le traitement au WGLL par rapport au groupe HTAP. Bien que les niveaux de protéine PDE5A ne différaient pas entre les groupes HTAP et Témoin lorsqu’ils étaient mesurés dans les tissus pulmonaires, cette constatation n’exclut pas que l’activité de l’enzyme puisse être élevée sans une augmentation simultanée de son expression. Cette observation est cohérente avec des travaux antérieurs, démontrant que seule la forme phosphorylée de la PDE5 indique une augmentation de l’activité PDE. Incidemment, notre investigation était limitée à la mesure des seuls niveaux de protéine PDE5 non phosphorylée ; par conséquent, nous n’avons observé aucun changement dans les valeurs du groupe traité au sildénafil par rapport au groupe Témoin, comme rapporté par d’autres. Bien qu’il soit bien publié que les niveaux élevés d’enzyme PDE5 sont associés aux processus pathologiques sous-jacents de la maladie, nous n’avons observé aucune détérioration significative des fonctions cardiaques ni des caractéristiques histologiques des animaux traités au WGLL par rapport au groupe HTAP (comme le montrent la Figure 1 et la Figure 2 et le Tableau 2), ce qui peut être partiellement expliqué par le fait que de nombreuses autres voies de signalisation sont impliquées dans la pathogenèse moléculaire de l’hypertension artérielle pulmonaire.
Malgré le fait que l’Allium sativum (ail cultivé) soit beaucoup plus caractérisé et décrit dans la littérature scientifique, avec les études antérieures, notre travail récent suggère que l’Allium ursinum est également un produit végétal précieux. De plus, il existe un nombre substantiel de rapports comparatifs dans lesquels l’Allium ursinum exerce des effets encore plus bénéfiques sur les modèles de maladie par rapport à l’Allium sativum. Enfin, et ce n’est pas le moindre, l’ail des ours est une plante facilement accessible et abordable, largement répandue à la fois en Europe et en Asie.
En résumé, le sildénafil a présenté une efficacité protectrice contre l’hypertension artérielle pulmonaire et le remodelage vasculaire induits par la monocrotaline, et les effets bénéfiques exercés par le traitement au WGLL sont bien comparables à la thérapie standard. Nos résultats indiquent aussi qu’il serait réalisable d’évaluer les actions synergiques de la supplémentation en sildénafil et en WGLL dans le traitement de l’hypertension artérielle pulmonaire.
4. Section expérimentale
4.1. Lyophilisation de l’échantillon et spectrométrie de masse
La lyophilisation des feuilles d’Allium ursinum a été réalisée comme décrit précédemment par les auteurs du présent article.
Les analyses par spectrométrie de masse (désorption/ionisation laser assistée par matrice–temps de vol, MALDI-TOF MS) des composés ont été réalisées en mode d’ions positifs à l’aide d’un spectromètre de masse MALDI-TOF Bruker Biflex III équipé d’une extraction d’ions retardée (Bruker Daltonics, Brême, Allemagne). La désorption/ionisation des molécules de l’échantillon a été effectuée avec un laser à azote de 337 nm d’une largeur d’impulsion de 3 ns. Les spectres de plusieurs (au moins 100) tirs laser ont été additionnés en utilisant des tensions d’accélération de 19 kV et de réflectron de 20 kV. Un étalonnage externe a été appliqué en utilisant les pics [M + Na]⁺ des cyclodextrines DP 6–8 m/z : 995,31, 1157,36, 1319,41 Da, respectivement. Le spectre a été obtenu à partir d’une substance matricielle d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque pour MALDI-MS (> 99,0 % (HPLC), Sigma Matrix) en mélangeant 10 µL de solution matricielle saturée dans éthanol:eau = 1:1 avec 10 µL d’échantillon dissous dans l’eau, puis 0,5 µL a été appliqué sur la cible de l’échantillon et a été laissé sécher à température ambiante. L’identification des composés a été effectuée sur la base de la masse des pics [M + H]⁺ ou [M + Na]⁺. Les calculs étaient basés sur la base de données du Metabolomics Workbench Data (« The Metabolomics Workbench », http://www.metabolomicsworkbench.org/).
4.2. Plan de l’étude
Des rats mâles de la souche Sprague Dawley pesant 200–250 g ont été achetés auprès de Charles River International Ltd. (Wilmington, MA, États-Unis). Les animaux étaient hébergés selon un cycle lumière-obscurité de 12:12 h dans un environnement exempt d’agents pathogènes spécifiques et avaient un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les poids corporels ont été mesurés chez tous les animaux au point final de l’étude (8 semaines). L’HTAP a été induite par une injection sous-cutanée unique de monocrotaline (MCT, 60 mg/kg, dans la région interscapulaire), l’alcaloïde toxique spécifique de Crotalaria spectabilis (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, États-Unis), tandis que le groupe témoin ne recevait que le véhicule, un tampon de diméthylsulfoxyde (tampon DMSO, groupe Témoin, n = 8). Les rats traités à la MCT ont ensuite été répartis en 3 sous-groupes comme suit : rats ayant reçu uniquement l’injection de MCT et ayant développé une HTAP (groupe HTAP, n = 8) ; rats ayant reçu l’injection de MCT et maintenus sur une nourriture standard enrichie en 2 % de lyophilisat de feuilles d’ail des ours (groupe WGLL, n = 8) ; et rats injectés à la MCT traités par 25 mg/kg de sildénafil quotidiennement par voie orale (technique du gavage) (groupe Sildénafil, n = 8). La nourriture enrichie en lyophilisat d’Allium ursinum a été produite au laboratoire du Département de technologie pharmaceutique de l’Université de Debrecen, Hongrie. Le sildénafil, ainsi que tous les autres produits chimiques utilisés dans la préparation des solutions tampons pour la procédure du cœur isolé travaillant, les colorations et la technique du Western blot, ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich Co. (Budapest, Hongrie). Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité d’éthique local de l’Université de Debrecen (25/2013DEMÁB, 29 janvier 2014), et les animaux ont reçu des soins humains conformément aux « Principles of Laboratory Animal Care » de la directive de l’UE 2010/63/UE pour les expériences animales.
4.3. Échocardiographie transthoracique (ETT)
Les études échocardiographiques ont été réalisées à l’aide d’un échographe Vivid E9 (GE Healthcare, Little Chalfont, Royaume-Uni) pour estimer les fonctions myocardiques sous anesthésie légère avec injection intramusculaire (i.m.) de kétamine/xylazine (50/5 mg/kg) au début et au point final des traitements. Le thorax était rasé et les animaux étaient positionnés en décubitus dorsal. Les images ont été obtenues à l’aide d’une sonde à réseau linéaire i13L (à 14 MHz) avec une haute résolution temporelle et spatiale. Des échocardiogrammes complets bidimensionnels, en mode M (au niveau des muscles papillaires), Doppler (PW) et Doppler tissulaire (TDI) ont été acquis et stockés numériquement pour une analyse ultérieure. L’imagerie Doppler au niveau des valves mitrale et aortique a été obtenue à partir des vues apicales 3 et 4 cavités. L’ECG était surveillé en continu pendant les examens échocardiographiques dans tous les cas. Les mesures incluaient l’épaisseur de la paroi libre interventriculaire et ventriculaire gauche en diastole et en systole (IVSs, IVSd), le diamètre interne du ventricule gauche en fin de diastole (LVIDd) et en fin de systole (LVIDs), et le diamètre de la racine aortique (Ao). Le volume télésystolique (ESV), le volume télédiastolique (EDV), le volume d’éjection systolique (SV) et la masse du ventricule gauche (masse VG) ont été calculés. La fraction de raccourcissement a été calculée à l’aide de l’équation (LVIDd − LVIDs)/LVIDd × 100 %, et la fraction d’éjection (EF) a été calculée par ordinateur à l’aide de la formule de Teichholz. L’excursion systolique maximale de l’anneau mitral (MAPSE) et l’excursion systolique maximale de l’anneau tricuspide (TAPSE) ont été évaluées en mode M, en mesurant la distance du mouvement de l’anneau mitral ou tricuspide entre la fin de la diastole et la fin de la systole. À partir de l’image de la vélocité du flux d’entrée mitral (Doppler), les mesures suivantes ont été obtenues : les ondes E et A maximales du ventricule gauche (vélocités de remplissage mitral précoce et tardif) et le rapport E sur A (E/A). Les paramètres de la voie d’éjection du ventricule gauche (LVOT) ont également été déterminés : les gradients de pression maximal et moyen (LVOT maxPG, LVOT meanPG), ainsi que les vélocités d’éjection maximale et moyenne (LVOT Vmax, LVOT Vmean, voir Figure 5). Les vélocités tissulaires au niveau de l’anneau latéral de la valve mitrale ont été estimées à l’aide du Doppler tissulaire spectral en déterminant les ondes systoliques (S’). La visualisation du ventricule droit et l’estimation de la fonction systolique à l’aide de la TAPSE étaient accessibles chez de nombreux rats ; cependant, la mesure de la fonction diastolique du ventricule droit était irréalisable dans la plupart des cas. Toutes les mesures ont été moyennées sur trois à cinq cycles cardiaques consécutifs et ont été effectuées par le même investigateur (Bela Juhasz), afin d’éviter la variabilité inter-observateurs. Les images acquises ont été analysées à l’aide du logiciel EchoPAC PC (GE Healthcare, Little Chalfont, Royaume-Uni) par deux autres investigateurs expérimentés (Daniel Priksz, Mariann Bombicz). La variabilité inter-observateurs ainsi que la variabilité intra-observateur étaient inférieures à 10 % dans tous les examens. Le temps total d’examen était généralement inférieur à 15 min ; ensuite, les rats étaient laissés se remettre de la procédure.
4.4. Paramètres du cœur isolé
Au point final de l’étude, les animaux ont été anesthésiés par une injection intramusculaire de kétamine/xylazine (100/10 mg/kg). Un bolus d’héparine a été administré (1000 U/kg de poids corporel, par voie intraveineuse) 15 min avant la chirurgie, pour éviter la thrombose. Une fois l’inconscience profonde atteinte, les cœurs ont été retirés par une incision sous-xiphoïdienne suivant une thoracotomie, placés dans un tampon glacé, et ont été rapidement canulés et perfusés via l’aorte à l’aide d’un appareil de Langendorff. Le temps écoulé entre l’ouverture de la cavité thoracique et le début de la perfusion n’a jamais dépassé 60 s. D’abord, une perfusion rétrograde a été initiée, à une pression de 100 cm H₂O pendant 10 min, ce qui a laissé le temps d’évacuer l’anesthésique. Le perfusat était un tampon bicarbonate de Krebs-Henseleit à pH 7,4, barboté avec du gaz Carbogène (95 % O₂–5 % CO₂) et contenant 118 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 1,7 mM de CaCl₂, 25 mM de NaHCO₃, 0,36 mM de KH₂PO₄, 1,2 mM de MgSO₄ et 10 mM de glucose. L’oreillette gauche a été canulée pendant la perfusion rétrograde via la veine pulmonaire. Une petite incision a été faite à la bifurcation des artères pulmonaires ; ainsi, tout l’effluent coronaire pouvait être recueilli par l’artère pulmonaire. Après la perfusion de Langendorff, le système a été basculé en mode travaillant et les cœurs ont été perfusés pendant 15 min. Les fonctions cardiaques, évaluées par les changements de fréquence cardiaque et de développement de la pression systolique maximale, ont été surveillées tout au long de la période de perfusion à l’aide d’un transducteur de pression fixé à la ligne d’éjection aortique. Les paramètres suivants ont été enregistrés : pression aortique (AoP), fréquence cardiaque (battements/min). Le flux aortique (AF, mL/min) et le flux coronaire (CF, mL/min) ont été mesurés à l’aide d’un débitmètre. Toutes les chirurgies ont été réalisées par le même investigateur (Balazs Varga), qui était en aveugle vis-à-vis des traitements, et les animaux ont été sacrifiés au hasard.
4.5. Évaluation histologique des échantillons de tissu myocardique et pulmonaire
À la suite de la procédure du cœur isolé travaillant, les cœurs ont été disséqués transversalement au niveau du milieu du VG et les échantillons ont été fixés pendant 24 h dans du formol neutre tamponné à 4 % (pH = 7,4) et préparés ensuite pour la coupe en paraffine. À partir des blocs fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), des coupes de 7 μm d’épaisseur ont été réalisées et colorées à l’hématoxyline-éosine (HE) pour visualiser l’architecture tissulaire. L’hypertrophie du VD (HVD) a été évaluée sur une coupe transversale complète du cœur et a été décrite comme le rapport VD/(VG + septum interventriculaire (SIV)).
Les coupes de poumon gauche fixées au formol et incluses en paraffine (7 μm) ont été colorées à l’HE et à l’Elastica van Gieson (EVG) pour l’analyse morphométrique des dimensions vasculaires. Les diamètres externes des petites artères pulmonaires ont été mesurés le long de la courbure la plus courte. L’épaisseur médiale relative des artères musculaires et la capacité de portage de la lumière (allant de < 50 µm de diamètre externe) ont été calculées avec la formule ((diamètre externe − diamètre interne)/diamètre externe × 100) (% MWT = (M1 + M2)/ED × 100) sur les lames colorées à l’EVG (Figure 6). Quinze images d’artériole par coupe de poumon ont été examinées par microscopie optique à l’aide d’un microscope Leica DM2500 avec caméra DFC 420 et logiciel Leica Application Suite V3 (Leica Camera AG, Solms, Allemagne). Les lames de microscope ont été analysées en aveugle et à la fois la taille de la lumière et les épaisseurs de la paroi vasculaire ont été calculées à l’aide du programme Scion for Windows Densitometry Image Version Alpha 4.0.3.2 (Scion Corporation, Frederick, MD, États-Unis).
4.6. Western blot
Les échantillons de tissu de VG et de poumon de rat congelés ont été homogénéisés puis bouillis dans un tampon d’échantillon pendant 10 min. La concentration finale de protéine ajustée était de 25 µg mL⁻¹. Le réactif BCA et l’étalon BSA ont été utilisés pour le test de quantification des protéines. Le gel de séparation était composé de 30 % de glycérol, 6 % d’acrylamide-bis, 0,2 mM de Tris, 4 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 0,4 % de dodécylsulfate de sodium (SDS) et la polymérisation des gels a été induite par du persulfate d’ammonium (10 m/m %) et du tétraméthyléthylènediamine. Le tampon de migration supérieur était composé de 0,1 mM de Tris, 150 mM de glycine et 0,1 % de SDS, et le gel était composé de 50 mM de Tris, 75 mM de glycine et 0,05 % de SDS. Une tension constante (70 V) a été utilisée pour la séparation. Un étalon de poids moléculaire précoloré (ProSieve QuadColor, Lonza ; Rockland, MA, États-Unis) a été utilisé comme marqueur de charge. Les protéines séparées dans les gels ont été transférées électrophorétiquement sur une membrane de nitrocellulose à 380 mA pendant 45 min. La membrane transférée a été bloquée avec 5 % de lait écrémé dans du sérum physiologique tamponné au Tris (TBS) contenant 1 % de Tween 20 (tampon TBS-T). Après lavage de la membrane avec du TBS-T, des anticorps primaires PDE5A et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, États-Unis) dilués dans du TBS-T avec 1 % de lait écrémé ont été ajoutés et incubés toute la nuit à 4 °C. Tous les anticorps étaient indiqués pour le Western blot, et ont été utilisés aux dilutions suggérées par les fabricants. Les anticorps liés ont été détectés par un anticorps secondaire anti-lapin Ig conjugué à la peroxydase de raifort suivi d’une détection ECL (Western Lightning Plus ECL, PerkinElmer ; Waltham, MA, États-Unis) et les signaux ont été enregistrés par un système d’imagerie (MF-Chemibis 3.2, Central European Biosystems ; Budapest, Hongrie). L’analyse quantitative des blots scannés a été réalisée à l’aide du programme Scion for Windows Densitometry Image Version Alpha 4.0.3.2 (Scion Corporation). L’intensité du signal pour les bandes correspondant à chaque protéine d’intérêt a été estimée et rapportée en unités arbitraires ± SEM.
4.7. Analyse des données et procédures statistiques
Toutes les données sont présentées comme les magnitudes moyennes de chaque résultat dans un groupe ± erreur type de la moyenne (SEM). L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’une analyse de variance à un facteur (ANOVA) avec post-test de Bonferroni (lorsque le test de normalité était réussi) ou par le test de Kruskal–Wallis avec post-test de Dunn (si le test de normalité n’était pas réussi). Les analyses statistiques ont été menées à l’aide du logiciel GraphPad Prism pour Windows, version 5.01 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, États-Unis). Les valeurs de probabilité (p) inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.
5. Conclusions
Notre récent article met en lumière les possibles effets protecteurs de la supplémentation en lyophilisat d’Allium ursinum dans l’hypertension artérielle pulmonaire, étudiée sur un modèle de rat de la maladie. À notre connaissance, il s’agit de la première étude à évaluer les possibles bénéfices d’Allium ursinum dans un modèle d’HTAP, et à le comparer directement à un inhibiteur de PDE bien connu, le sildénafil. Nos résultats démontrent que la supplémentation en WGLL exerce une protection contre l’hypertension artérielle pulmonaire induite par la MCT dans un modèle de rat, montrée par des changements significatifs des fonctions échocardiographiques et du cœur isolé, ou des analyses histologiques. Les fonctions systoliques du cœur droit évaluées par échocardiographie ont montré des améliorations de l’excursion systolique du plan de l’anneau tricuspide, tandis que les expériences de cœur isolé ont révélé une augmentation du flux aortique du ventricule gauche et du débit cardiaque. Ces résultats ont été davantage soutenus par les analyses de Western blot, où la supplémentation en WGLL n’a montré aucun changement des niveaux d’expression de la PDE5A par rapport aux valeurs mesurées dans les échantillons prélevés chez les animaux HTAP. En revanche, l’histologie a révélé que l’augmentation de l’épaisseur de la paroi médiale causée par le traitement à la monocrotaline était contrecarrée par le traitement au WGLL. Notre hypothèse est partiellement confirmée expérimentalement, car la supplémentation en WGLL, un produit naturel peu coûteux et raisonnable, supprime les symptômes de l’hypertension pulmonaire induite par la MCT dans un modèle de rat, mais ses effets protecteurs sur le système cardiovasculaire semblent indépendants de la voie de la PDE5 ; ainsi, les mécanismes sous-jacents nécessitent des investigations supplémentaires.