Au-delà de l’usage traditionnel d’Alchemilla vulgaris : activité génoprotectrice et antitumorale in vitro
Référence : Molecules 2022. — PMC9740270 / PMID 36500205 · DOI 10.3390/molecules27238113 Type : etude in vitro · Plante : Alchemille commune · Propriété → Cancer Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Alchemilla vulgaris L. (alchémille commune) a été utilisée pendant des siècles en Europe et dans les pays balkaniques pour le traitement de nombreuses affections et maladies du système reproducteur ; pourtant, certaines des activités biologiques de l’alchémille commune ont été peu étudiées et négligées. La présente étude visait à estimer le potentiel de l’extrait éthanolique d’A. vulgaris provenant du sud-est de la Serbie à prévenir et supprimer le développement tumoral in vitro, potentiel validé par ses propriétés antioxydantes, génoprotectrices et cytotoxiques. Au total, 45 composés ont été détectés par analyse UHPLC–HRMS dans l’extrait éthanolique d’A. vulgaris. La mesure de l’activité antioxydante a révélé le potentiel significatif de l’extrait testé à piéger les radicaux libres. En outre, l’analyse des micronoyaux a montré un effet protecteur in vitro contre les aberrations chromosomiques dans les lymphocytes humains périphériques. L’extrait d’A. vulgaris a fortement supprimé la croissance de lignées cellulaires humaines dérivées de différents types de tumeurs (MCF-7, A375, A549 et HCT116). L’effet antitumoral observé se réalise par le blocage de la division cellulaire, l’apoptose dépendante des caspases et la mort cellulaire autophagique. Notre étude a montré qu’Alchemilla vulgaris L. est une source précieuse de composés bioactifs capables de protéger la structure subcellulaire contre les dommages, prévenant ainsi la tumorigenèse et supprimant la croissance des cellules tumorales.
1 Introduction
Les données ethnopharmacologiques sont d’une importance cruciale pour la découverte de nouveaux composés bioactifs prometteurs, ainsi que pour la vérification des drogues végétales déjà acceptées. Il est donc nécessaire de préserver les connaissances traditionnelles relatives aux plantes médicinales, tout en répondant à la nécessité de leur collecte durable dans la nature. De nos jours, les approches thérapeutiques sont passées de l’attaque et de la destruction directe des cellules endommagées et des microorganismes pathogènes à l’activation de processus d’auto-guérison et de protection lors de l’initiation de différents mécanismes de réparation du corps humain. Une telle conception a un impact important sur la recherche scientifique centrée sur la bioactivité des produits naturels. De nombreuses affections pathologiques ne peuvent pas être entièrement traitées par les produits pharmaceutiques standards, et certaines drogues et certains extraits végétaux sont donc considérés comme une bonne alternative aux médicaments conventionnels en raison de leurs propriétés synergiques et de leurs effets secondaires minimes.
Parmi les plantes ayant une longue histoire en médecine populaire et une reconnaissance conséquente dans différentes pharmacopées figurent les espèces du genre Alchemilla.
Le genre Alchemilla L. comprend plus de 300 espèces de plantes vivaces herbacées formant des touffes, poussant dans les prairies humides d’altitude en Europe, en Asie occidentale et en Amérique du Nord, mais aussi présentes dans les régions montagneuses d’Amérique du Sud et d’Afrique. Alchemilla vulgaris L., communément connue sous le nom d’alchémille commune, est l’espèce la plus étudiée du genre. Les interprétations taxonomiques récentes d’A. vulgaris supposent que le taxon est un agrégat comprenant 12 microespèces apomictiques morphologiquement similaires qui s’hybrident fréquemment. La Pharmacopée européenne fait référence à Alchemilla vulgaris L. sensu latiore.
L’alchémille commune est largement utilisée en médecine populaire dans le monde entier. Les parties supérieures de la plante ont été rapportées pour le traitement du diabète, de la sclérose en plaques, de l’anémie, des ulcères, des hernies, des troubles gynécologiques et abdominaux, des plaies, des éruptions cutanées et des inflammations. En Europe du Sud-Est et dans les Balkans, les espèces d’Alchemilla sont utilisées pour les plaintes gynécologiques, menstruelles et ménopausiques ; les infections respiratoires ; la diarrhée ; le diabète ; les maladies rénales et hépatiques ; la perte de poids ; les troubles cutanés ; et différentes affections inflammatoires.
En outre, cette plante médicinale présente des propriétés antibactériennes, antifongiques et antivirales. Dans le contexte de la résistance bactérienne aux antibiotiques, les drogues et extraits végétaux sont considérés comme des agents antibactériens puissants, sans risque d’augmentation supplémentaire de la résistance aux agents antimicrobiens standards. Une étude récente ciblant les effets de l’infusion d’alchémille commune après une exposition hypoxique a indiqué les propriétés neuroprotectrices de la drogue végétale. Neagu et al. ont démontré l’effet inhibiteur de l’acétylcholinestérase et de la tyrosinase de l’extrait d’Alchemilla vulgaris, et il a donc été supposé que l’espèce pourrait être utilisée dans la prévention et le traitement des maladies neurodégénératives. Jusqu’à présent, certaines des activités biologiques de l’alchémille commune ont été peu étudiées et négligées. En particulier, l’activité anticancéreuse d’Alchemilla vulgaris a été rapportée précédemment par Vlaisavljević et al. et Ibrahim et al. Alors que Vlaisavljević et al. ont rapporté une forte activité anticancéreuse d’Alchemilla vulgaris contre les tumeurs œstrogéno-dépendantes des organes reproducteurs féminins, Ibrahim et al. ont démontré l’activité cytotoxique de l’extrait méthanolique de racine d’Alchemilla vulgaris contre plusieurs autres lignées cellulaires in vitro. Outre l’activité génoprotectrice et antioxydante, cette étude a montré pour la première fois le potentiel d’un extrait éthanolique des parties aériennes d’Alchemilla vulgaris L. à diminuer le potentiel malin de lignées cellulaires tumorales hormono-indépendantes par le blocage de la division cellulaire, ainsi que par l’induction des types I et II de mort cellulaire programmée.
2 Résultats et discussion
2.1 Caractérisation phytochimique de l’extrait éthanolique d’A. vulgaris — UHPLC−HRMS
L’extrait éthanolique d’A. vulgaris a été étudié par UHPLC-HRMS. Au total, 45 composés ([ ]) ont été caractérisés de manière provisoire sur la base de leurs paramètres de comportement chromatographique, tels que le temps de rétention, les valeurs m/z, la formule moléculaire, l’erreur et le schéma de fragmentation, et par comparaison avec ceux décrits dans la littérature et dans les bibliothèques LC-MS en accès libre. Les composés identifiés appartiennent à différentes classes métaboliques, principalement les phénoliques.
2.1.1 Glycosides de flavonols et de flavones
Vingt-deux dérivés de flavonols et deux glycosides de flavones ont été détectés dans l’extrait d’A. vulgaris et représentaient le principal groupe de métabolites. La majorité de ces composés étaient des dérivés de quercétine et de kaempférol, identifiés sur la base de leurs ions fragments abondants apparaissant à m/z 301 pour la quercétine (8, 9, 20, 21, 24–26, 29, 31, 32 et 36) et à m/z 285 pour le kaempférol (28, 33–35, 39 et 41).
La quercétine (40) a été identifiée par l’ion moléculaire déprotoné à m/z 301 [M − H]− et par des fragments proéminents à m/z 179,00 et m/z 151,00 obtenus par fragmentation RDA dans le spectre MS/MS. La perte neutre de 176 (composé 26), 162 (25 et 29) et 132 Da (31 et 32) à partir de l’ion précurseur dans les spectres MS/MS a révélé la présence de fractions acide glucuronique, hexose et pentose. En outre, l’intensité plus élevée de l’anion radicalaire de la quercétine [Y0 − H]− à m/z 300 par rapport à celle à m/z 301 [Y0]−, ainsi que les fragments caractéristiques à m/z 271 [Y0 − H − CO − H]− et 255 [Y0 − H − CO2 − H]−, ont permis de déterminer ces composés comme des quercétine 3-O-monoglycosides. Ainsi, le composé 26 a été identifié comme quercétine-3-O-glucuronide (miquélianine), les composés 25 et 29 comme quercétine-3-O-galactoside (hypéroside) et quercétine-3-O-glucoside (isoquercitrine), et la paire 31/32 comme quercétine 3-O-α-L-arabinopyranoside (guaijavérine) et quercétine 3-O-α-L-arabinofuranoside (avicularine). Le composé 24 a montré [M − H]− à m/z 609 et un schéma de fragmentation similaire à celui décrit ci-dessus. Par conséquent, 24 a été identifié comme rutine (quercétine 3-O-rutinoside). Les composés 9 et 20 étaient des diglycosides de quercétine, car ils présentaient le même ion [M − H]− à m/z 595, mais différaient par le schéma de fragmentation de l’ion précurseur. Ainsi, le spectre MS/MS de l’ion précurseur du composé 9 a montré [M − H−132]− et [M − H − 133]− (m/z 463 et 462) et [M − H − 162]− (m/z 433), en raison de la perte de fractions pentose et hexose, ainsi que [Y0 − 2H]− (m/z 299), caractéristique des quercétine 3,7-O-diglycosides. Le composé 9 a été identifié comme quercétine-3-O-arabinoside-7-O-glucoside sur la base de l’intensité plus élevée du pic à m/z 433 par rapport à celui à m/z 463. En outre, le pic de base à m/z 300 [Y0 − H]− et les pics proéminents à m/z 271 et 255 ont permis d’identifier le composé 20 comme quercétine-3-O-vicianoside (quercétine 3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1–6)-β-D-glucopyranoside). Le composé 21 a montré [M − H]− à m/z 579. Son spectre MS/MS a montré deux ions fragments à m/z 447 et 433, dus à la perte d’une unité pentose (132 Da) et d’une unité désoxyhexose (146 Da), ainsi que les ions fragments [Y0 − 2H]− (m/z 299) et [Y0 − H − CO − H]− (m/z 271), caractéristiques d’un aglycone de quercétine. L’intensité plus élevée du pic à m/z 447 par rapport à celle à m/z 433 a soutenu l’attachement des fractions pentose et désoxyhexose aux positions C-3 et C-7 de la molécule de quercétine, respectivement. Par conséquent, le composé 21 a été identifié comme quercétine-3-O-pentoside-7-O-désoxyhexoside. Le composé 8 a été provisoirement identifié comme hexoside-glucuronide de quercétine en raison de la présence d’un ion moléculaire déprotoné à m/z 639 et de pics proéminents à m/z 301 [M − H − 338]− (perte d’une unité hexoside-glucuronique) et 463 [M − H − 176]− (perte d’une unité glucuronide). Le composé 36 a été identifié comme quercétine 3-O-acétylglucoside en raison de la présence d’un ion moléculaire [M − H]− à m/z 505 et d’un ion produit à m/z 300 (perte d’une unité acétylglucosyle, 205 Da). La quercétine (40) et ses glycosides (9, 24–26, 29 et 32) ont été décrits comme composants d’A. vulgaris. La guaijavérine (31), les diglycosides (20, 21) et la quercétine 3-O-acétylglucoside (36) sont décrits pour la première fois comme composants d’A. vulgaris. La guaijavérine (31) avait été précédemment isolée d’A. xanthochlora Rothm., d’A. achtarowii et d’A. jumrukczalica.
Les composés 28, 33–35, 39 et 41 étaient des dérivés kaempférol 3-O-glycosylés, car leurs spectres MS/MS présentaient des ions caractéristiques à m/z 284 [Y0 − H]−, 285 [Y0]−, 255 [Y0 − H − CO − H]− et 227. En outre, la perte de 308 Da pour le composé 28, 176 Da pour le composé 33, 162 Da pour le composé 34 et 132 Da pour le composé 35 à partir des ions moléculaires déprotonés a révélé la présence de fractions rutinose, acide glucuronique, hexose et pentose. Ainsi, les composés ont été identifiés comme kaempférol-3-O-rutinoside (28), kaempférol-3-O-glucuronide (33), kaempférol-3-O-glucoside astragaline (34) et kaempférol-3-O-xyloside (35). Les composés 39 et 41 ont été identifiés comme kaempférol 3-O-acétylglucoside et kaempférol 3-O-(6′′-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside (tiliroside), car leurs spectres montraient [M − H]− à m/z 489 et 593, correspondant aux formules moléculaires C23H21O12 et C30H25O13, et un ion fragment à 285 dû à l’élimination d’unités acétylglucose (−205 Da) et coumaroylglucose (−308 Da), respectivement. Tous les composés du kaempférol, à l’exception du kaempférol-3-O-glucoside (34) et du tiliroside (41), sont décrits ici pour la première fois comme composants d’A. vulgaris. Le kaempférol-3-O-glucuronide (33) avait été précédemment isolé d’A. speciosa.
Les composés 12 et 17–19 ont été identifiés respectivement comme glycosides de myricétine et de gossypétine, par comparaison de leurs temps de rétention et de leur comportement spectral de masse avec ceux publiés dans la littérature. La myricétine et la gossypétine sont des pentahydroxyflavonols différant par la position d’un groupe OH et ont donné une fragmentation similaire dans leurs spectres MS/MS avec les ions [Y0]− et [Y0 − H]− (m/z 317 et 316) et [Y0 − H]− et [Y0 − H − CO − H2O]− (m/z 271). Le composé 12 a été identifié comme myricétine 3-O-hexoside, car il présentait [M − H]− à m/z 479 et un fragment MS/MS dû à la perte d’hexose (162 Da) à m/z 317 [Y0]−, ainsi que l’intensité plus élevée du pic à m/z 316 [Y0 − H]−. Les composés 17–19 étaient des diglycosides de gossypétine, car ils présentaient [M − H]− à m/z 625 (17) et 595 (18 et 19), ainsi que des fragments dans les spectres MS/MS formés par l’élimination de deux unités sucre individuelles : pentose et hexose dans (17) (m/z 479 [M − H − 146]− et 463 [M − H − 162]−) et pentose et désoxyhexose dans (18 et 19) (m/z 463 et 449). L’intensité plus élevée du pic à m/z 479 par rapport à celles à m/z 463 (dans 17) et 449 (dans 18 et 19) a soutenu l’attachement des fractions pentose et hexose/désoxyhexose aux positions C-3 et C-7 de la molécule de gossypétine, respectivement. Les composés 17–19 ont été provisoirement identifiés comme gossypétine 3-O-hexoside-7-O-rhamnoside et isomères 1 et 2 de gossypétine 3-O-désoxyhexoside-7-O-rhamnoside. Tous ces composés sont décrits pour la première fois chez A. vulgaris. Cependant, la présence de glycosides de gossypétine dans l’extrait étudié n’était pas très surprenante, car des dérivés de gossypétine avaient été isolés d’A. mollis. Il convient de mentionner que des dérivés de myricétine n’ont pas été détectés jusqu’à présent chez les espèces d’Alchemilla.
Le composé 30 a montré [M − H]− à m/z 447. Le spectre MS/MS présentait les schémas de fragmentation caractéristiques de la lutéoline (m/z 285 et 199). Par conséquent, le composé 30 a été identifié comme lutéoline 7-O-glucoside. Ce composé a déjà été décrit comme un composant d’A. vulgaris.
Le composé 38 a montré [M − H]− à m/z 475, libérant des fragments MS/MS à m/z 299 [M − H − 176]− et 284 [M − H − 176 − 15]− attribués à la perte successive d’une fraction glucuronyle et d’un groupe méthyle, et a été identifié comme chrysœriol 7-O-glucuronide. Le composé 38 est maintenant rapporté pour la première fois chez A. vulgaris, bien que le chrysœriol ait été précédemment détecté chez A. vulgaris.
2.1.2 Acides phénoliques et leurs dérivés
L’acide gallique (1), l’acide chlorogénique (3), l’acide caféique (7), l’acide syringique (11), l’acide p-coumarique (13) et les acides p-coumaroylquiniques (10 et 15) ont été identifiés dans l’extrait d’A. vulgaris étudié. Les spectres générés pour ces composés en mode ion négatif ont donné la molécule déprotonée [M − H]− et un ion produit caractéristique [M − H − 44]− dû à la perte de CO2 dans leurs spectres MS/MS. Le spectre MS/MS de l’acide chlorogénique (3) contenait également des ions produits caractéristiques à m/z 191, 179 et 173 correspondant à la perte d’acide quinique [M − H − 162]−, d’une unité d’acide caféique et à la perte de CO2 [191 − 44]−. Les spectres MS/MS des composés 10 et 15 ont montré la fragmentation typique de l’acide p-coumarique à m/z 163 et 119 et la perte de l’unité d’acide p-coumarique à m/z 191.
Les spectres des composés 2 et 6 ont montré des ions m/z 325 (C15H17O8) et m/z 163 correspondant à la molécule déprotonée [M − H]− et à la perte d’une unité glucose à m/z 163, et ont été identifiés comme des isomères de p-coumaroyl hexose.
L’acide ellagique (23) avait [M − H]− à m/z 301 et des ions fragments caractéristiques à m/z 283 [M − H − H2O]−, 229 [M − H − CO2 − CO]−, 201 [M-H − CO2 − CO − CO]− et 185 [M − H − 2CO2 − CO]−, formés à partir de l’ion précurseur dans le spectre MS/MS.
Les composés 16 et 22 avaient les molécules déprotonées [M − H]− à m/z 463 et 433 et l’ion produit à m/z 301 dans leurs spectres MS/MS, en raison de la perte d’un hexose (−162 Da) et d’un pentose (−142 Da), ainsi qu’un schéma de fragmentation typique de l’acide ellagique. Par conséquent, ces composés ont été provisoirement identifiés comme acide ellagique-hexose et acide ellagique-pentose.
Une étude de la littérature a montré que l’acide gallique (1), l’acide chlorogénique (3), l’acide caféique (7), l’acide p-coumarique (13) et l’acide ellagique (23) avaient été détectés dans des extraits d’A. vulgaris, tandis que tous les autres sont trouvés pour la première fois chez les espèces d’Alchemilla.
2.1.3 Ellagitanins et autres composés phénoliques
Le composé 4 avait [M − H]− à m/z 633 et des ions fragments majeurs à m/z 463 [M − H − 170]− et 301 [M − H − 170 − 162]−, en raison de la perte séquentielle d’acide gallique et d’un groupe hexose, lié à une unité hexahydroxydiphénoyle (HHDP). Par conséquent, le composé 4 a été identifié comme galloyl-HDDP-hexose, précédemment trouvé chez A. vulgaris et A. mollis.
Le composé 27, l’agrimoniine, a montré un fragment à m/z 934 [M − 2H]2−, correspondant à une unité galloyl-bis-glucose, suivie ensuite par des ions de fragmentation à m/z 633 et 301 en raison de la perte d’une unité HHDP (302 Da) et d’un résidu galloylglucose (332 Da). L’agrimoniine est un ellagitanin commun chez les espèces d’Alchemilla.
Les composés 14 et 5 ont montré des schémas de fragmentation identiques. Le composé 14, de formule moléculaire C12H8O6 et avec une molécule protonée [M − H]− à m/z 247, a généré des ions produits à m/z 219 et 191, résultant de la perte successive d’une unité CO. De même, dans le cas du composé 5, l’ion produit majeur à m/z 247 a été formé par décarboxylation de son ion précurseur à m/z 291. La fragmentation ultérieure concordait avec celle mentionnée ci-dessus pour le composé 14. Selon les données de la littérature, les composés 14 et 5 ont été identifiés comme brévifoline et acide brévifolincarboxylique. De plus, l’acide brévifolincarboxylique a récemment été décrit comme un composant d’A. viridiflora.
2.1.4 Triterpénoïdes
Les composés 37 et 42–44 ont été provisoirement identifiés comme hexosides d’acides triterpéniques par comparaison de leurs caractéristiques spectrales de masse avec celles précédemment rapportées. Leurs ions précurseurs à m/z 711 (37) et 695 (42–44) et les fragments majeurs à m/z 503 et 487 [M + HCOO − 162]−, respectivement, étaient en accord avec les adduits formiate d’esters hexosylés d’acides triterpéniques pentacycliques tétrahydroxylés (37) et trihydroxylés (42–44) de type ursane et/ou oléane. Le composé 45 a été provisoirement identifié comme arjungénine (acide 2,19,23-trihydroxyoléanolique), car il montrait [M − H]− à m/z 503 et un fragment caractéristique à m/z 409. Il s’agit du premier rapport de glycosides d’acides triterpéniques chez A. vulgaris. Une étude de la littérature a révélé la présence d’acides ursolique, oléanolique, 2a-hydroxyursolique, 2,19-dihydroxyursolique (acide tormentique) et 2,3,19-trihydroxyurs-12-én-28-oïque (acide euscophique) chez A. vulgaris, A. faeroensis et A. alpina.
2.2 Phénoliques et flavonoïdes totaux et activité antioxydante
Les résultats présentés dans [ ] représentent les résultats des teneurs en phénoliques et flavonoïdes totaux et de la capacité antioxydante. Les résultats pour le TPC sont en accord avec les résultats obtenus par Vlaisavljevic et al. Selon Boroja et al., les résultats pour TAC et DPPH étaient plus faibles que ceux de l’étude actuelle, ce qui pourrait être une conséquence de solvants, de procédures d’extraction et de produits chimiques standards utilisés différents dans les essais réalisés. Cependant, nos résultats concordent avec d’autres études sur la capacité antioxydante des extraits d’Alchemilla, indiquant toutes la forte corrélation entre une teneur élevée en phénoliques et l’activité antioxydante, en particulier concernant une proportion élevée de flavonoïdes totaux et de tanins dans l’extrait végétal.
2.3 Effet génoprotecteur de l’extrait d’A. vulgaris
Trois concentrations différentes d’extrait d’A. vulgaris ont été testées in vitro pour leur effet protecteur contre les aberrations chromosomiques dans les lymphocytes humains périphériques au moyen d’un essai CBMN : 2,0 µg/mL, 4,0 µg/mL et 6,0 µg/mL. La fréquence et la distribution des MN ont été évaluées. La formation de MN après traitement par un agent alkylant, la mitomycine C (MMC), et la prévention de la formation de MN après traitement par l’agent du système de réparation de l’ADN amifostine WR-2721 ont été déterminées. Le système d’essai était un essai sur lymphocytes de sang périphérique humain, vérifiant les effets clastogènes ou anticlastogènes. Les effets clastogènes, anticlastogènes ou modulateurs possibles des composés étudiés ont été déterminés sur la base de l’action de ces deux agents. Les résultats sont présentés dans [ ].
La culture cellulaire de lymphocytes traitée avec 1 μg/mL d’amifostine WR-2721 a montré une diminution significative (p < 0,01) de 18,6 % de la fréquence des MN par rapport aux cultures cellulaires témoins ([ ]). Le traitement par un agent alkylant MMC à la concentration de 0,2 µg/mL a montré une augmentation significative (p < 0,01) de la fréquence des MN de 24,2 % par rapport aux cultures cellulaires témoins ([ ]).
Trois concentrations différentes d’extrait d’A. vulgaris ont été testées pour leur effet protecteur in vitro contre les aberrations chromosomiques dans les lymphocytes humains périphériques en utilisant l’essai MN bloqué par la cytochalasine B. L’extrait d’A. vulgaris aux concentrations de 2,0 µg/mL, 4,0 µg/mL et 6,0 µg/mL a provoqué une légère diminution de la fréquence des MN de 20,5 %, 18,2 % et 16,3 %, respectivement, par rapport aux cultures cellulaires témoins ([ ]). Plus important encore, l’extrait d’A. vulgaris à la concentration de 2,0 µg/mL avait encore un effet protecteur plus élevé que le protecteur synthétique, l’amifostine WR-2721, à la concentration de 1,0 µg/mL ([ ]).
L’effet de différentes concentrations d’extrait d’A. vulgaris sur la prolifération cellulaire a été étudié par détermination de l’indice de prolifération avec blocage de la cytokinèse (CBPI). [ ] montre les valeurs moyennes de CBPI et les erreurs standards calculées pour différentes concentrations d’extrait d’A. vulgaris. Les valeurs comparables de CBPI des extraits et du témoin amifostine WR-2721 suggèrent un effet inhibiteur des extraits testés sur la prolifération lymphocytaire. Dans cette étude, nous avons constaté que les concentrations plus faibles d’extrait d’A. vulgaris possèdent un effet bénéfique sur la culture cellulaire de lymphocytes en diminuant la fréquence des MN. Comme le nombre de micronoyaux sert d’indicateur des dommages à l’ADN, ces résultats indiquent que l’extrait d’A. vulgaris protège l’ADN et diminue la peroxydation lipidique des lymphocytes, principalement induite par les radicaux anion superoxyde. Les radicaux libres perturbent l’homéostasie cellulaire par peroxydation des lipides membranaires, oxydation des protéines, dommages aux bases et formation d’adduits dans l’ADN, ce qui conduit finalement à la mort cellulaire si les dommages dépassent la capacité de réparation de la cellule.
2.4 Propriété antitumorale de l’extrait d’A. vulgaris
Les lignées cellulaires humaines de cancer du sein hormono-dépendant MCF-7, de mélanome anaplasique A375, d’adénocarcinome pulmonaire A549 et de carcinome du côlon HCT116 ont été exposées à une large gamme de concentrations d’extrait éthanolique d’A. vulgaris ; après 72 h d’incubation, la viabilité cellulaire a été déterminée par la mesure de la respiration mitochondriale ou de la synthèse protéique, au moyen des tests MTT et SRB, respectivement. Comme le montre [ ], les données obtenues dans les deux essais ont confirmé une forte diminution dose-dépendante de la viabilité dans toutes les cultures testées exposées à l’extrait d’A. vulgaris, indépendamment de l’origine et des caractéristiques des cellules malignes. Comme la viabilité des cellules primaires d’exsudat péritonéal isolées d’animaux sains n’a pas été affectée par la même gamme de doses dans un dispositif expérimental comparable ([ ]), on peut conclure que l’extrait d’A. vulgaris a montré une sélectivité pour le phénotype malin, même indépendante du statut hormonal comme on le croyait précédemment. Les valeurs d’IC50 de toutes les lignées cellulaires ([ ]) ont illustré l’efficacité la plus élevée de l’extrait d’A. vulgaris contre les cellules hormono-indépendantes A549 et HCT116.
Pour définir un mécanisme précis au-delà de l’effet de l’extrait d’A. vulgaris sur la viabilité cellulaire, une analyse cytométrique en flux de la mort cellulaire a été réalisée, en utilisant la lignée cellulaire A549 comme représentante. En effet, après 72 h d’incubation en présence d’une dose IC50 d’extrait d’A. vulgaris, une quantité significative de cellules apoptotiques précoces et tardives a été détectée ([ ]). La présence d’apoptose après le traitement a en outre été confirmée au niveau morphologique, en utilisant la coloration DAPI des noyaux cellulaires. De nombreuses cellules avec des noyaux de forme anormale et une chromatine condensée étaient visibles dans les cultures exposées à l’extrait d’A. vulgaris ([ ]). En concordance avec une présence significative de cellules apoptotiques, une amplification de l’activité totale des caspases a été détectée dans les cultures traitées par l’extrait d’A. vulgaris ([ ]). D’autre part, la prolifération des cellules survivantes était abrogée, confirmant que l’extrait supprime également la division cellulaire ([ ]). Fait intéressant, une quantité significative d’autophagosomes a été détectée dans les cellules cultivées en présence de l’extrait d’A. vulgaris ([ ]), tandis que la prévention de la formation d’autophagosomes lors d’un traitement concomitant avec l’inhibiteur 3-MA a restauré de manière spectaculaire la viabilité cellulaire ([ ]). Le résultat obtenu a clairement confirmé que le processus autophagique intensifié déclenché par le traitement représentait une part importante de l’activité cytotoxique de l’extrait d’A. vulgaris.
Pour exclure la possibilité que le stress oxydant médie l’action antitumorale de l’extrait d’A. vulgaris, la production de peroxyde d’hydrogène et de peroxynitrite a été estimée par le colorant rédox-sensible DHR. Cependant, l’exposition à l’extrait d’A. vulgaris n’a que légèrement inhibé la production de ROS et de RNS, indiquant leur insignifiance dans le déclenchement du processus apoptotique ([ ]). En résumé, l’activité antitumorale de l’extrait d’A. vulgaris pourrait être attribuée à l’inhibition de la prolifération et à la mort cellulaire apoptotique dépendante des caspases et autophagique.
L’analyse détaillée du contenu de l’extrait a révélé la présence de nombreux composés biologiquement actifs ayant un potentiel antitumoral déjà reconnu. Les flavonoïdes appartiennent à un groupe riche de composés polyphénoliques dans le règne végétal. De nombreuses données confirment leur fort impact sur la santé humaine, les plaçant au centre de différentes études scientifiques. Les membres de la sous-classe des flavonols, quercétine, rutine et isoquercétine, soit sous forme de glycosides soit d’aglycones, ont montré des effets antioxydants, antiprolifératifs, anti-inflammatoires, antihypertenseurs et antidiabétiques. La spécificité des composés naturellement présents réside dans leur grande adaptabilité, reflétée dans le soutien des tissus sains et la guérison des états pathologiques. Ce double potentiel de certains extraits ou composés séparés est souvent inexplicable, tandis que les mécanismes qu’ils déclenchent peuvent même être opposés dans différents tissus et cellules selon la plateforme sur laquelle ils sont arrivés. Ainsi, l’isoquercétine a empêché la peroxydation lipidique par interférence avec l’activité de la xanthine oxydase, chélation des métaux redox-actifs ou piégeage direct des ROS, présentant des caractéristiques protectrices. D’autre part, le même composé a affecté les voies de signalisation impliquées dans la progression tumorale, telles que la voie de signalisation Wnt et la protéine kinase activée par les mitogènes, affectant directement la viabilité tumorale. De même, la quercétine, outre ses fortes capacités cytoprotectrices, modifie la progression du cycle cellulaire dans les cellules néoplasiques, inhibant leur prolifération, induisant les types I et II de mort cellulaire programmée et bloquant les métastases. Il est important de noter que certains composés végétaux possèdent un potentiel hautement sélectif et agissent comme thérapie ciblée, affectant certaines voies de signalisation ou molécules importantes pour le maintien du phénotype malin. Par exemple, l’acide gallique fonctionne comme antagoniste de l’EGFR, supprimant la progression du CBNPC EGFR-positif dans certaines conditions. En outre, ce composé et des composés végétaux similaires ont interféré avec la chimiothérapie, renforçant son efficacité en modifiant le rapport des molécules pro/antiapoptotiques.
Outre les quercétine, isoquercétine et acide gallique mentionnés, plusieurs autres constituants présents dans l’extrait d’A. vulgaris pourraient également être bénéfiques dans les affections néoplasiques, puisque chacun d’eux possède le potentiel d’influencer directement ou indirectement la progression de la maladie en soi et en interaction avec d’autres composés de l’extrait. L’expérience issue des données ethnobotaniques et de la pratique clinique confirme que les extraits végétaux totaux exercent généralement des effets plus puissants que les composés séparés. De plus, certains d’entre eux, tels que l’acide quinique, ont le potentiel intrinsèque de « reconnaître » les tumeurs à sélectines régulées à la hausse et d’induire une augmentation transitoire de la perméabilité endothéliale afin de traverser la couche endothéliale. Cela aboutira à une accumulation tumorale plus importante et à la délivrance de nombreux composés ayant le potentiel direct de supprimer la division ou la viabilité des cellules tumorales.
Le phénomène décrit explique au moins en partie pourquoi de tels composés peuvent agir simultanément comme destructeurs pour la tumeur et protecteurs pour le tissu normal. Dans cette étude, le principe de dualité de l’extrait d’A. vulgaris a été illustré par la génoprotection des lymphocytes primaires exposés à une certaine gamme de doses de l’extrait, tandis que le même extrait exerce un potentiel cytotoxique contre les cellules transformées à des doses 5 à 15 fois plus élevées que celles appliquées dans l’essai des micronoyaux. Compte tenu du fait que des composés tels que l’acide quinique, dotés d’un potentiel de ciblage du tissu cancéreux, sont présents dans l’extrait d’A. vulgaris, on peut s’attendre aux multiples effets bénéfiques de son application in vivo.
3 Matériels et méthodes
3.1 Matériel végétal et préparations d’extraits
Le matériel végétal (nom officiel — Alchemilla vulgaris L. ; nom local — virak ; nom anglais — lady’s mantle) a été collecté dans le sud-est de la Serbie, dans la région du plateau de Vlasina (N 42.8779987, E 22.0592615) en 2020. Les parties aériennes ont été collectées au stade de pleine floraison. Le matériel végétal a été séché à l’air et broyé avant la procédure d’extraction. L’identité taxonomique et botanique a été confirmée par la professeure Zora Dajić-Stevanović. Le spécimen témoin (n° RS-120718-1) est conservé dans l’herbier du Département de botanique appliquée, Faculté d’agriculture, Université de Belgrade. Le statut d’espèce d’Alchemilla vulgaris L. est accepté dans les bases de données végétales pertinentes (par exemple, http://www.worldfloraonline.org/ (consulté le 21 octobre 2022)).
Après la collecte, les parties aériennes d’Alchemilla vulgaris L. ont été convenablement séchées à l’air dans une pièce bien ventilée (à l’ombre à 4 °C) et broyées. La quantité de 100 g d’échantillon végétal a été extraite (période de 2 h) dans de l’éthanol chaud à 60 °C (1 L), trois fois. Après séparation du matériau brut, les extraits collectés ont été combinés et évaporés sous vide à 60 °C à l’aide d’un évaporateur rotatif. L’extrait semi-solide obtenu, sans solvant, a été scellé et conservé à 4 °C pour une analyse ultérieure.
3.2 Analyses phytochimiques
La teneur en composés phytochimiques sélectionnés a été déterminée par application des méthodes spectrophotométriques standards, à savoir Folin–Ciocalteu (phénoliques totaux, TPC, Nouvelle-Galles du Sud, Australie), chlorure d’aluminium (flavonoïdes totaux, TFC, Daly City, CA, États-Unis) et méthode d’Arnow (dérivés totaux de l’acide dihydroxycinnamique, HCA, Nashville, TN, États-Unis), et exprimée en mg/g d’équivalents d’acide gallique (GAE), de quercétine (QE) et d’acide chlorogénique (CGAE), calculés respectivement sur le poids sec (DW) de l’échantillon. Pour une caractérisation phytochimique plus approfondie, une UHPLC–HRMS a été réalisée.
3.2.1 Analyse UHPLC–HRMS
L’analyse UHPLC–HRMS a été réalisée au moyen d’un Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 RSLC (Germering, Bavière, Allemagne) comprenant un dégazeur 6 canaux SRD-3600, une pompe à gradient haute pression HPG-3400RS, un passeur d’échantillons WPS-3000TRS et un compartiment de colonne TCC-3000RS, couplé à un Thermo Scientific Q Exactive Plus (Brême, Allemagne) équipé d’une ionisation électrospray chauffée (HESI-II). La séparation UHPLC a été obtenue sur une colonne en phase inverse Kromasil Eternity XT C18 (Nouryon, Göteborg, Suède) (2,1 × 100 mm, 1,8 μm) équipée d’une précolonne SecurityGuard ULTRA UHPLC EVO C18 (Phenomenex, Torrance, CA, États-Unis) maintenue à 40 °C. La phase mobile binaire était constituée de A : 0,1 % d’acide formique dans l’eau et B : 0,1 % d’acide formique dans l’acétonitrile. Le temps d’analyse était de 34,5 min. Le gradient suivant a été utilisé : la phase mobile a été maintenue à 5 % B pendant 1 min, progressivement portée à 30 % B en 24 min, progressivement augmentée à 40 % B en 5 min, progressivement augmentée à 95 % B en 2,5 min et maintenue à 95 % B pendant 2 min. Le système a ensuite été ramené aux conditions initiales de 5 % B et équilibré pendant 4,5 min. Le débit et le volume d’injection ont été fixés à 300 µL/min et 2 µL, respectivement. Les paramètres de réglage du spectromètre de masse étaient les suivants : tension de pulvérisation, 2,5 kV ; débit du gaz de gaine, 38 unités arbitraires (u.a.) ; débit du gaz auxiliaire, 12 u.a. ; température du capillaire et température du chauffage de la sonde, 320 °C ; et niveau RF S-lens, 50. L’acquisition a été réalisée en modes MS plein balayage et MS2 dépendant des données. Les spectres plein balayage sur la plage m/z de 100 à 1500 ont été acquis en mode ionisation négative à une résolution de 70 000. Les autres paramètres instrumentaux pour le mode MS complet ont été fixés comme suit : cible de contrôle automatique du gain (AGC), 3 × 10^6 ; temps d’injection maximal (IT), 80 ms. Pour le mode ddMS2, les paramètres instrumentaux étaient les suivants : résolution, 17 500 ; cible AGC, 1 × 10^5 ; IT maximal, 50 ms ; Top5 ; fenêtre d’isolement, 2,0 m/z ; énergie de collision normalisée étagée (NCE), 20, 40 et 60 eV. L’acquisition et le traitement des données ont été effectués avec le logiciel Xcalibur 4.0 (Thermo Scientific, Inc., Waltham, MA, États-Unis).
3.2.2 Teneur totale en phénoliques (TPC)
La méthode de Folin–Ciocalteu (FC) a été utilisée pour la détermination du TPC. Les résultats ont été exprimés en milligrammes d’équivalents d’acide férulique (FAE) par gramme de poids sec (DW).
3.2.3 Teneur totale en flavonoïdes (TFC)
La détermination du TFC a été évaluée au moyen de la méthode spectrophotométrique décrite. Le TFC a été déterminé à l’aide d’une courbe d’étalonnage avec la quercétine (Q) comme standard, et les résultats ont été exprimés en milligrammes d’équivalents de quercétine (QE) par gramme de DW.
3.2.4 Teneur totale en dérivés d’acide dihydroxycinnamique (HCA)
La teneur totale en HCA a été estimée à l’aide de la méthode décrite. La teneur totale en HCA dans l’extrait a été déterminée à partir de la courbe d’étalonnage avec l’acide chlorogénique (CGA) comme standard. Les résultats ont été exprimés en milligrammes d’équivalents de CGA (CGAE) par gramme de DW.
3.3 Essais d’activité antioxydante
3.3.1 Essai DPPH (radical 2,2′-diphényl-1-picrylhydrazyle) (DPPH)
La détermination de l’activité de piégeage des radicaux libres des extraits a été réalisée selon la méthode décrite. Le pourcentage d’inhibition du DPPH a été calculé au moyen de la formule suivante : % d’inhibition = [Ab − As]/Ab × 100 (1)
Ab — l’absorbance du blanc ; As — l’absorbance de l’extrait d’échantillon.
3.3.2 Essai du pouvoir réducteur ferrique (FRP)
L’activité antioxydante de l’extrait d’A. vulgaris a été déterminée par essai FRP selon la méthode précédemment décrite. L’acide ascorbique (AA) a été utilisé comme standard, et les résultats obtenus ont été exprimés en milligrammes d’équivalents d’acide ascorbique (AAE) par gramme de DW.
3.3.3 Essai de l’activité antioxydante réductrice cuivrique (CUPRAC)
L’essai CUPRAC a été réalisé selon la procédure décrite. Une courbe d’étalonnage a été préparée en utilisant différentes concentrations d’acide ascorbique comme standard, et les résultats ont été exprimés en milligrammes d’équivalents d’acide ascorbique (AAE) par gramme de DW.
3.3.4 Essai de capacité antioxydante totale (TAC)
L’essai TAC a été conduit au moyen de la méthode indiquée. La capacité antioxydante a été calculée selon une courbe d’étalonnage préparée avec l’acide ascorbique comme standard. Les résultats ont été exprimés en milligrammes d’équivalents d’acide ascorbique (AAE) par gramme de DW.
Dans chaque méthode, tous les échantillons ont été analysés en triplicat (n = 3). L’absorbance de la solution résultante a été mesurée avec un spectrophotomètre UV/visible.
3.4 Étude antitumorale in vitro
3.4.1 Réactifs et cellules
Le milieu RPMI-1640 et le sérum bovin fœtal (FBS) ont été obtenus auprès de Capricorn Scientific GmbH (Hesse, Allemagne). Le tampon phosphate salin (PBS), le diméthylsulfoxyde (DMSO), l’orange d’acridine (AO), l’iodure de propidium (PI), la sulforhodamine B (SRB), l’ester succinimidyl de diacétate de carboxyfluorescéine (CFSE) et la 3-méthyladénine (3-MA) ont été achetés chez Sigma (St. Louis, MO, États-Unis). La solution de pénicilline–streptomycine a été achetée auprès de Biological Industries (Cromwell, CT, États-Unis). L’annexine V-FITC (AnnV) a été acquise auprès de BD (Pharmingen, San Diego, SAD). Le DAPI fluoromounth G a été acheté auprès de Southern Biotech (Birmingham, AL, États-Unis). La dihydrorhodamine 123 (DHR) provenait de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, États-Unis). Le bromure de 3-(4,5 diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) a été obtenu auprès d’AppliChem (Darmstadt, Allemagne), tandis qu’ApoStat provenait de R&D Systems (Minneapolis, MN, États-Unis). Les lignées cellulaires A375 (mélanome humain), HCT116 (carcinome colorectal humain), A549 (carcinome pulmonaire humain) et MCF-7 (adénocarcinome mammaire humain) ont été achetées auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, États-Unis).
Toutes les cellules ont été maintenues en routine dans du milieu RPMI-1640 tamponné par HEPES, supplémenté avec 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 2 mM de L-glutamine, 0,01 % de pyruvate de sodium, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine. Les cellules ont été cultivées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2. La densité de MCF-7, HCT116 et A375 au moment de l’ensemencement dans des plaques 96 puits pour la détermination de la viabilité cellulaire était de 4 × 10^3 cellules/puits, et celle d’A549 était de 2 × 10^3 cellules/puits. Pour les analyses cytométriques en flux concernant la lignée cellulaire A549 dans des plaques 6 puits, la densité était de 7 × 10^4 cellules/puits.
Les cellules d’exsudat péritonéal ont été collectées par lavage avec du PBS glacé à partir de la cavité péritonéale de souris C57BL/6. Les souris provenaient de notre propre animalerie à l’Institut de recherche biologique « Siniša Stanković » (IBISS) — Institut national de la République de Serbie, Université de Belgrade (Belgrade, Serbie). Les cellules d’exsudat ont été cultivées dans du milieu RPMI-1640 tamponné par HEPES, supplémenté avec 5 % de FBS inactivé par la chaleur, 2 mM de L-glutamine, 0,01 % de pyruvate de sodium, pénicilline (100 unités/mL) et streptomycine (100 μg/mL), à 37 °C dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2. Ensuite, les cellules ont été comptées, ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 1,5 × 10^5 cellules/puits et laissées pendant 2 h pour adhérer. Avant le traitement, les cellules non adhérentes ont été retirées. La manipulation des animaux et le protocole de l’étude étaient en accord avec les directives locales et les directives de la Communauté européenne (directive CEE de 1986 ; 86/609/CEE) et approuvés par le comité institutionnel local de soin et d’utilisation des animaux (IACUC). L’approbation des protocoles expérimentaux (autorisation n° 323-07-120098/2020-05) a été accordée par le comité national d’autorisation du Département du bien-être animal, Direction vétérinaire, Ministère de l’Agriculture, de la Foresterie et de la Gestion de l’eau de la République de Serbie.
La solution mère d’extrait éthanolique d’Alchemilla vulgaris a été préparée dans du DMSO à une concentration de 200 mg/mL avant utilisation, et la concentration finale de DMSO dans les solutions de travail était de 1 %.
3.4.2 Détermination de la viabilité cellulaire par les essais SRB et MTT
Toutes les lignées cellulaires ont été ensemencées pendant la nuit et exposées à une large gamme de concentrations d’extrait d’A. vulgaris pendant 72 h ; après la période d’incubation, la viabilité cellulaire a été évaluée au moyen des essais SRB et MTT.
Pour la détection de l’activité déshydrogénase mitochondriale, les cellules ont été incubées avec une solution de MTT (0,5 mg/mL) pendant environ une demi-heure, jusqu’à formation de cristaux de formazan violets. Ensuite, le colorant a été éliminé et du DMSO a été ajouté pour dissoudre le formazan. Pour l’essai SRB, les cellules ont été fixées avec 10 % de TCA pendant 2 h à 4 °C et colorées avec une solution de SRB à 0,4 % pendant 30 min à RT. Les cellules colorées ont été dissoutes dans 1 % d’acide acétique, lavées et séchées pendant la nuit. L’absorbance du colorant dissous (dans un tampon TRIS 10 mM pendant 20 min) a été mesurée à 540 nm. La viabilité cellulaire a été calculée en pourcentage du témoin, fixé arbitrairement à 100 %.
3.4.3 Colorations AnnV/PI, Apostat et AO
Pour toutes les analyses cytométriques en flux, les cellules A549 ont été ensemencées pendant la nuit et traitées avec une dose IC50 d’extrait d’A. vulgaris (35 μg/mL) pendant 72 h.
Pour la détection de l’activation des caspases, les cellules ont été colorées avec l’inhibiteur pan-caspase Apostat conformément au protocole du fabricant. Pour la détection des autophagosomes, les cellules ont été colorées avec une solution de 1 µg/mL d’AO pendant 15 min à 37 °C. Pour la détection de la mort cellulaire apoptotique, les cellules ont été colorées avec 15 µg/mL d’annexine V-FITC et 15 µg/mL de PI, puis analysées au moyen de CyFlow Space Partec avec le logiciel PartecFloMax (Munster, Allemagne).
3.4.4 Coloration CFSE
Avant le traitement, les cellules A549 ont été colorées avec du CFSE à une concentration finale de 1 μM et incubées pendant 10 min à 37 °C. Ensuite, les cellules ont été lavées, ensemencées pendant la nuit et traitées avec une dose IC50 d’extrait d’A. vulgaris (35 μg/mL) pendant 72 h, puis analysées par cytométrie en flux.
3.4.5 Mesure de la génération de ROS/RNS
En mesurant l’intensité de la fluorescence verte émise par le colorant rédox-sensible DHR, la production d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote a été détectée. Les cellules A549 ont été incubées avec DHR pendant 20 min à 37 °C, ensemencées pendant la nuit et traitées avec une dose IC50 d’extrait d’A. vulgaris (35 μg/mL) pendant 72 h. À la fin de la période d’incubation, les cellules ont été analysées par cytométrie en flux.
3.4.6 Coloration DAPI sur lames à chambres
Pour évaluer les signes morphologiques d’apoptose, les cellules A549 ont été ensemencées dans des lames à 4 chambres à une densité de 1 × 10^4 cellules/puits et traitées avec une dose IC50 (35 μg/mL) d’extrait d’A. vulgaris pendant 72 h. Ensuite, les cellules ont été fixées avec 4 % (w/v) de paraformaldéhyde pendant 15 min à RT, lavées et couvertes avec DAPI fluoromounth-G avant analyse. Les lames à chambres ont été analysées au moyen d’un microscope à fluorescence inversé Zeiss AxioObserver Z1 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Allemagne) à un grossissement de 400×.
3.5 Essai des micronoyaux avec blocage de la cytokinèse (CBMN)
Des échantillons de sang veineux ont été obtenus avec des vacutainers stériles héparinés auprès de 4 volontaires féminines saines (2 × 5 mL de chacune) qui n’avaient pas été exposées à des produits chimiques, des médicaments ou d’autres substances. Les volontaires ont signé un consentement éclairé et ont donné leur permission pour l’utilisation de leur sang à des fins expérimentales. L’étude était conforme au code d’éthique de l’Association médicale mondiale (Déclaration d’Helsinki de 1975, telle que révisée en 2013). Les échantillons sanguins ont été obtenus à l’unité médicale des Installations nucléaires de Serbie, Institut des sciences nucléaires « Vinca », conformément aux réglementations serbes de santé et d’éthique en vigueur (2005).
Des cultures de lymphocytes de sang périphérique humain (2 × 10^6), remises en suspension dans 5 mL de milieu RPMI-1640 supplémenté avec 15 % de sérum de veau et 2,4 μg/mL de phytohémagglutinine (PHA) (Invitrogen-Gibco-BRL), ont été traitées avec trois concentrations différentes d’extrait d’A. vulgaris (2 μg/mL, 4 μg/mL et 6 μg/mL) après 1 h d’exposition à la PHA. Une culture cellulaire contenant de l’amifostine WR-2721 (Marligen-Biosciences, MD, États-Unis) (1 µg/mL) a servi de témoin positif, tandis qu’une culture avec mitomycine C (MMC) (0,2 μg/mL, dans un tampon phosphate) était le témoin négatif. Toutes les cultures cellulaires ont été incubées à 37 °C. Le traitement avec l’extrait d’A. vulgaris a duré 19 h, après quoi les cultures cellulaires ont été rincées avec du milieu pur, transférées dans 5 mL de milieu RPMI 1640 frais (RPMI 1640 Medium + GlutaMAX + 25 mM HEPES ; Invitrogen-Gibco-BRL) et incubées pendant 72 h supplémentaires. L’incidence des micronoyaux (MN) apparaissant spontanément dans les échantillons témoins a été évaluée.
Pour la préparation des MN, la méthode modifiée de blocage de la cytokinèse a été utilisée. La cytochalasine B (Invitrogen-Gibco-BRL) a été ajoutée aux échantillons après 44 h de culture à une concentration finale de 6 μg/mL, et les cultures de lymphocytes ont été incubées pendant encore 24 h. Après 72 h, les cellules ont été lavées avec 0,9 % de NaCl (Merck, Sharp, & Dohme GMBH, Vienne, Autriche), collectées par centrifugation et traitées avec la solution hypotonique à 37 °C. La solution hypotonique était constituée de 0,56 % KCl + 0,9 % NaCl (mélangés en volumes égaux). La suspension cellulaire a été préfixée dans méthanol/acide acétique (3:1), lavée trois fois avec le fixateur et déposée goutte à goutte sur une lame propre. Les lames ont été séchées à l’air et colorées avec du Giemsa alcalin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) (2 %). Au moins 1000 cellules binucléées (BN) par échantillon ont été évaluées, et les MN ont été enregistrés selon les critères indiqués.
Comme l’expression des micronoyaux dépend de la prolifération cellulaire, la quantification de la prolifération cellulaire et de la mort cellulaire doit être réalisée pour obtenir une évaluation solide de la cinétique cellulaire et des fréquences de micronoyaux. Le CBPI a été calculé comme suggéré.
Le nombre de cellules binucléées avec un, deux, trois MN ou plus a ensuite été tabulé. Les données pour chaque traitement ont été exprimées comme la fréquence des MN pour 1000 cellules binucléées.
3.6 Analyse statistique
Le test t de Student a été utilisé pour évaluer la significativité des différences entre groupes, et des valeurs de p inférieures à 0,05 ont été considérées comme indiquant une significativité statistique.
Pour l’essai des micronoyaux, la significativité statistique de la différence entre les paires de données a été évaluée par analyse de variance (ANOVA à un facteur), suivie du test de Tukey. Une différence statistique a été considérée comme significative à p < 0,01. L’indice calculé est présenté comme le pourcentage de changement entre différents groupes.
4 Conclusions
Les résultats de cette étude soutiennent fortement les données collectées historiquement concernant le potentiel curatif d’Alchemilla vulgaris L. du sud-est de l’Europe, qui était traditionnellement utilisée comme plante médicinale depuis des siècles. Cette étude a confirmé que l’extrait éthanolique d’Alchemilla vulgaris L. représente une source précieuse de composés bioactifs dotés de multiples propriétés biologiques bénéfiques, notamment une forte activité antitumorale et des caractéristiques génoprotectrices remarquables résultant, au moins en partie, du fort potentiel antioxydant de cette plante. Les recherches futures sur l’activité antitumorale de l’alchémille commune devraient cibler les effets des composants individuels de son extrait, ainsi que les effets d’une éventuelle activité synergique de différents composés bioactifs, en plus de révéler leurs mécanismes complexes responsables de l’action anticancéreuse. Toutes les observations mentionnées ci-dessus font de cette plante une candidate précieuse pour de futures recherches dans le domaine de la découverte de médicaments.