Alchemilla vulgaris module la cardiotoxicité induite par l’isoprénaline : interaction du stress oxydatif, de l’inflammation, de l’autophagie et de l’apoptose
Référence : Front Pharmacol 2024. — PMCID PMC11335554 / PMID 39170697 · DOI 10.3389/fphar.2024.1394557 Type : etude in vivo · Plante : Alchemille commune · Propriété → Circulation & coeur Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Introduction : L’isoprénaline (ISO) est considérée comme un agoniste β adrénergique non sélectif. Elle régule la contractilité myocardique et peut provoquer des lésions des tissus cardiaques. Alchemilla vulgaris (AV) est une plante médicinale qui a suscité une attention considérable en raison de ses composants bioactifs anti-inflammatoires et antioxydants. La présente étude a évalué le potentiel cardioprotecteur d’AV vis-à-vis des lésions myocardiques induites par l’ISO. Méthodes : Quatre groupes de souris ont été utilisés : un groupe témoin ayant reçu une solution saline, un groupe ISO (85 mg/kg, S.C.), un groupe ISO + AV100 et un groupe ISO + AV200 (les souris ont reçu 100 ou 200 mg/kg d’AV par voie orale avec l’ISO). Résultats et discussion : L’ISO a induit des lésions cardiaques notables, mises en évidence par une perturbation histopathologique nette et des altérations des paramètres biochimiques. De façon intéressante, le traitement par AV atténue le stress oxydatif provoqué par l’ISO, comme l’indiquent une amélioration substantielle des activités de la superoxyde dismutase (SOD) et de la catalase (CAT) et de la teneur en glutathion réduit (GSH), ainsi qu’une réduction considérable des concentrations de malondialdéhyde (MDA). De plus, une régulation négative notable des biomarqueurs inflammatoires (IL-1β, TNF-α et RAGE) et de la voie NF-κB/p65 a été observée chez les animaux exposés à l’ISO après le traitement par AV. En outre, le marqueur pro-apoptotique Bax a été régulé négativement, de même que les marqueurs d’autophagie Beclin1 et LC3, chez les animaux exposés à l’ISO lorsqu’ils étaient traités par AV. Le prétraitement par AV a significativement atténué les lésions cardiaques induites par l’ISO de manière liée à la dose, possiblement en raison de ses propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires. De façon intéressante, lorsque l’AV était administrée à des doses plus élevées, une restauration remarquable des lésions cardiaques induites par l’ISO a été mise en évidence.
1 Introduction
L’isoprénaline (chlorhydrate d’isoprénaline, ISO ; C11H17NO3) est un agoniste synthétique non sélectif des récepteurs β-adrénergiques, analogue iso-propylamine de l’adrénaline. Elle stimule la fréquence cardiaque et la contractilité myocardique et est couramment utilisée pour traiter la bradycardie, le bloc cardiaque, l’arrêt cardiaque et, occasionnellement, l’asthme. La cardiotoxicité est l’un des effets indésirables les plus fréquents de l’administration d’ISO. Le mécanisme sous-jacent des lésions cardiaques déclenchées par l’ISO est complexe et multifactoriel, les radicaux libres dérivés de l’oxygène et le stress oxydatif étant présumés constituer des mécanismes critiques impliqués dans la cardiotoxicité de l’ISO. L’ISO génère une quinone, qui est convertie en anions superoxyde (O2–) et en peroxydes d’hydrogène (H2O2) par l’oxygène moléculaire. La surproduction d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) provoque un dysfonctionnement cellulaire, une dégradation des protéines et des lipides, ainsi que des lésions de l’ADN, entraînant des dommages cellulaires irréparables et étant associée à la pathogenèse de la plupart des affections cardiovasculaires. Bien que le traitement par la médecine moderne soit efficace, il est associé à davantage d’effets indésirables. Par conséquent, l’exploration des produits naturels comme alternative innovante pour la prise en charge des affections cardiaques a récemment suscité une grande attention. Les médicaments à base de plantes sont abordables et présentent moins d’effets secondaires. Des recherches antérieures ont démontré que des remèdes à base de plantes ou leurs composés actifs peuvent atténuer la cardiotoxicité induite par l’ISO, tels que Sanguisorba minor, Nerium oleander Linn, Fumaria indica et l’esculetine.
Alchemilla vulgaris (AV), ou « manteau de Notre-Dame », ou « pied-de-lion », ou « pied-d’ours » comme elle est connue, est une plante herbacée vivace appartenant à la famille des Rosaceae. Cette plante médicinale est assez efficace contre de nombreuses maladies gynécologiques et problèmes reproductifs. Elle est également utilisée pour traiter les troubles cutanés et digestifs. Selon la Pharmacopée européenne 6.0, AV a été désignée comme plante médicinale dotée d’activités pharmacodynamiques diverses. AV contient un large éventail de composés phytochimiques, notamment des tanins (catéchine, acide gallique et acide ellagique), des flavonoïdes (quercétine, lutéoline et proanthocyanidines), des acides phénoliques et des terpènes, ainsi que des acides gras et leurs esters possédant des propriétés antibactériennes, antioxydantes, anti-inflammatoires et antifongiques. Plusieurs rapports ont documenté le potentiel d’AV contre les dommages oxydatifs associés à différents toxiques, tels que les lésions hépatorénales et testiculaires induites par le cisplatine, les lésions reproductives induites par le sulfate de zinc et les lésions hépatorénales induites par le tétrachlorure de carbone.
Malgré les recherches considérables qui ont été menées pour expliquer les effets bénéfiques d’AV, aucun rapport publié n’a étudié son efficacité contre les lésions myocardiques. Par conséquent, cette étude a évalué les effets cardioprotecteurs de l’extrait d’AV sur la cardiotoxicité induite par l’injection d’ISO chez des souris albinos. Les biomarqueurs enzymatiques cardiaques, l’état oxydatif, les niveaux d’expression génique liés à l’inflammation, les voies de signalisation apoptotiques et l’histoarchitecture myocardique ont été évalués.
2 Matériels et méthodes
2.1 Évaluation de l’amarrage moléculaire
2.1.1 Préparation des ligands
À l’aide du format SDF, les structures tridimensionnelles (3D) de l’ISO ont été récupérées dans la base de données PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). De plus, les structures 3D des composés bioactifs d’AV ont été récupérées dans la base de données LOTUS (https://lotus.naturalproducts.net/).
2.1.2 Préparation des protéines
Les structures 3D de la glutathion synthétase de souris, de CAT, SOD1, SOD2, SOD3, Bcl-2, TNF-α, IL-1β, NF-κB1, Bax, RAGE et HMBG1 ont été récupérées dans la base de données UniProt (https://www.uniprot.org/). La minimisation énergétique des protéines cibles a été préparée pour l’amarrage à l’aide du logiciel UCSF Chimera.
2.1.3 Visualisation et interactions d’amarrage
Les interactions protéine-ligand et l’amarrage ont été réalisés à l’aide d’InstaDock, tandis que leur visualisation a été effectuée avec le logiciel BIOVIA Discovery Visualization 2024 Client.
2.2 Préparation de l’extrait d’Alchemilla vulgaris
Le matériel végétal d’AV (parties aériennes et racines) a été obtenu sur un marché local à Mansoura, en Égypte. L’identification taxonomique a été fournie par le Département de botanique, Faculté des sciences, Université de Mansoura, Égypte. Le matériel végétal séché a été broyé en poudre. Chaque 10 g de matériel végétal séché a été trempé et mélangé avec 100 mL d’eau distillée à 60°C avant un traitement par ultrasons (Ultrasonic Cleaner USC-500 TH, VWR, Darmstadt, Allemagne) pendant 1 h à température ambiante. Avant utilisation, les extraits végétaux ont été filtrés. Enfin, l’extrait d’AV a été analysé phytochimiquement par HPLC comme décrit dans le matériel supplémentaire et le tableau supplémentaire S1.
2.3 Étude animale et approbation du protocole
Cette étude a été approuvée par l’Institutional Animal Care and Use Committee de la Faculté de médecine vétérinaire, Université de Mansoura [approbation no MU-ACUC (VM.R.23.06.69)]. Le protocole expérimental est également conforme aux lignes directrices ARRIVE 2.0 pour les expériences animales.
Des souris albinos mâles pesant 15–20 g et âgées de 5–6 semaines ont été obtenues auprès de l’unité animale de la Faculté de pharmacie, Université de Mansoura, Égypte. Avant l’expérience, les souris ont été maintenues dans des conditions d’hébergement standard pendant 2 semaines dans des conditions environnementales appropriées (21°C ± 2°C, 55% ± 5% d’humidité et cycle lumière/obscurité de 12/12 h). Toutes les souris ont reçu un régime standard avec un accès illimité à l’eau.
Après 2 semaines d’acclimatation, les souris ont été réparties uniformément en quatre groupes de cinq souris chacun. Les souris du groupe témoin (CTL) ont reçu une solution saline normale ; les souris du groupe ISO ont reçu une injection sous-cutanée (S.C.) d’ISO (Sigma-Aldrich, MO, États-Unis ; 85 mg/kg de poids corporel) ; les souris des groupes ISO + AV100 et ISO + AV200 ont reçu la même dose d’ISO et 100 ou 200 mg/kg d’extrait d’AV par voie orale. Les souris ont été prétraitées avec AV pendant sept jours consécutifs et l’ISO a été administré les 8e et 9e jours.
Le 10e jour, l’expérience a été arrêtée. Toutes les souris ont été euthanasiées par une injection intrapéritonéale de pentobarbital (45 mg/kg). Ensuite, du sang a été prélevé au niveau du sinus orbitaire, centrifugé pendant 10 min à 3 000 ×g, et les sérums ont été recueillis et conservés à −20°C pour une évaluation biochimique ultérieure. Le cœur a été rapidement retiré et lavé avec une solution saline physiologique froide pour éliminer tout caillot sanguin, puis découpé en trois morceaux. Une portion a été conservée dans du formol tamponné (10%) pour l’histopathologie. Le deuxième morceau de tissu frais de chaque cœur a été utilisé pour isoler l’ARN en vue de l’analyse de l’expression génique et conservé à −80°C. Le morceau de tissu frais restant a été conservé à −20°C pour l’étude ultérieure des marqueurs de la cascade oxydative.
2.4 Dosage des marqueurs sériques cardiaques
Les activités de la créatine kinase-myoglobine binding (CK-MB) et de la lactate déshydrogénase (LDH) ont été estimées à l’aide de kits colorimétriques obtenus auprès de Human (Wiesbaden, Allemagne).
2.5 Évaluation des biomarqueurs oxydatifs
Les biomarqueurs oxydatifs, notamment le malondialdéhyde (MDA ; marqueur de la peroxydation lipidique) et le glutathion réduit (GSH), ont été évalués respectivement à 532 nm et à 412 nm. De plus, les enzymes antioxydantes telles que la superoxyde dismutase (SOD) et la catalase (CAT) ont été mesurées à 560 nm et 240 nm dans les homogénats cardiaques conformément aux instructions du fabricant (Laboratory Biodiagnostics, Le Caire, Égypte).
2.6 Évaluation des biomarqueurs inflammatoires cardiaques
L’évaluation de l’inflammation dans les homogénats de tissu cardiaque a été réalisée à l’aide de kits ELISA disponibles dans le commerce pour l’interleukine-1β (IL-1β ; no de catalogue : MBS763059, MyBioSource, CA, États-Unis) et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α ; no de catalogue : LS-F5192, LifeSpan Biosciences Inc., MA, États-Unis), conformément aux instructions du fabricant.
2.7 Isolement de l’ARN et qRT-PCR
L’ARN total a été extrait des échantillons de tissu cardiaque à l’aide du réactif TRIzol. L’ADNc a été synthétisé à l’aide de Revert Aid™ H Minus Reverse Transcriptase (Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc., Canada) conformément aux instructions du fabricant. La PCR a été effectuée avec un kit Quanti Fast SYBR Green RT-PCR (Qiagen, Hilden, Allemagne). Toutes les réactions ont été réalisées en double à l’aide du système ViiA™ 7 (Thermo Fisher Scientific, CA, États-Unis). Les procédures de cyclage PCR ont été effectuées selon les protocoles publiés par Habotta et al. L’approche ΔΔCt a été employée pour déterminer les niveaux relatifs d’expression génique entre les différents groupes. La β-actine a été utilisée comme gène de ménage. Les séquences d’amorces (Jena Bioscience, Jena, Allemagne) utilisées pour déterminer les niveaux d’expression génique de la protéine 2 du lymphome à cellules B (Bcl-2), de Bcl-2-associated X (Bax), de Beclin1, du récepteur des produits finaux de glycation avancée (RAGE) et de NF-κB/p65 sont fournies dans le tableau supplémentaire S2.
2.8 Évaluation histoarchitecturale
Les échantillons de tissu cardiaque fixés au formol ont été déshydratés dans une série d’alcools gradués. Ensuite, les tissus ont été clarifiés au xylène avant l’inclusion en paraffine. Les blocs tissulaires ont été coupés en sections de 5 µm d’épaisseur, montées sur des lames de microscope en verre, déparaffinées, colorées à l’H&E pour l’évaluation histologique et scannées à l’aide d’un système d’imagerie intégré à une caméra numérique (DM300, Leica, Allemagne). Les lésions microscopiques ont été classées comme « 0 », aucune lésion pathologique détectée ; « 1 » légère, lésions affectant <10% du tissu cardiaque ; « 2 » modérée, lésions affectant 10%–50% des tissus cardiaques ; et « 3 » sévère, lésions affectant >50% des tissus cardiaques.
2.9 Analyse immunohistochimique
L’immunomarquage a été réalisé à l’aide de la procédure du complexe avidine-biotine-peroxydase. Brièvement, les coupes en paraffine ont été successivement déparaffinées et déshydratées à l’aide d’une série d’éthanol graduée. Les antigènes ont été récupérés par récupération d’épitopes induite par la chaleur pendant 30 min, puis refroidis à température ambiante pendant 10 min. Ensuite, les peroxydases endogènes cardiaques ont été inhibées pendant 5 min à l’aide d’une solution de H2O2 à 3%. Cela a été suivi de trois lavages de 5 minutes dans du phosphate-buffered saline (PBS). Les sections ont été incubées à 4°C pendant la nuit avec des anticorps polyclonaux de lapin contre high mobility group box 1 (HMGB1 ; Wuhan Servicebio Technology, Wuhan, Hubei, Chine, dilution 1:1 000) et la protéine light chain 3 associée aux microtubules (LC3 I, dilution 1:100). Puis les sections ont été incubées pendant 24 h à 4°C avec des anticorps secondaires polyclonaux de lapin. Les sections ont été rincées avec du PBS, de l’IgG anti-lapin de chèvre biotinylée a été ajoutée, et les sections ont été incubées pendant 45 min à 30°C avec des complexes streptavidine-peroxydase. L’activité peroxydase a été mesurée à l’aide de 3,3′-diaminobenzidine. Les images ont été capturées avec un Nikon Eclipse E200-LED à un grossissement original de ×400. Les régions positivement colorées pour HMGB1 ou LC3 ont été évaluées à l’aide du logiciel ImageJ (version 1.53 t ; Wayne Rasband et contributeurs, NIH, États-Unis). Un système de score quantitatif pour les protéines immunomarquées (H-Score) utilisant le « pourcentage de surface » a été réalisé. Le pourcentage de surface pour les sections colorées pour HMGB1 et LC3 a été déterminé à l’aide du système informatique d’analyse d’images Nikon Eclipse E200-LED (États-Unis). L’analyseur d’images comprenait un microscope de recherche Nikon, un moniteur couleur, une caméra vidéo couleur et un disque dur d’ordinateur relié au microscope. Le système était contrôlé à l’aide du logiciel ImageJ (version 1.53 t ; Wayne Rasband et contributeurs, National Institute of Health, États-Unis). Le logiciel d’analyse H-Score a été utilisé pour enregistrer et identifier l’intensité de coloration et le taux positif (%) de chaque catégorie d’intensité pour les cellules cibles à l’aide de l’échelle suivante : négatif (score ; 0), faible, léger (score ; 1), modéré (score ; 2) et fort (score ; 3).
2.10 Analyses statistiques
Les moyennes ± SEM ont été utilisées pour représenter les résultats. Une ANOVA à un facteur a été employée pour évaluer les résultats. Le test de Duncan a été utilisé comme test post hoc pour comparer la signification entre les groupes, et les valeurs de P inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. La version 4.0.2 de RStudio a été utilisée pour analyser et visualiser les données.
3 Résultats
3.1 Amarrage moléculaire
Les interactions moléculaires de l’ISO avec la glutathion synthétase, CAT, SOD1, SOD2, SOD3 et Bcl-2 sont représentées dans la figure 1. L’ISO a interagi avec les sites de liaison de la glutathion synthétase, de CAT, SOD1, SOD2, SOD3 et Bcl-2 avec des énergies libres de liaison de −5,5, −5,9, −5,3, −4,9, −4,7 et −5,8 kcal/mol, respectivement.
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Les résultats du tableau 1 et de la figure 2 ont exploré l’interaction d’amarrage moléculaire des composés bioactifs d’AV avec TNF-α, IL-1β, NF-κB1, Bax, RAGE et HMBG1. L’acide oléanolique a interagi avec les sites de liaison de TNF-α, Bax, RAGE et HMBG1 avec des énergies libres de liaison de −7,3, −7,2, −8,0 et −7,1 kcal/mol, respectivement. Un autre composé, l’acide ursolique, était lié au site de liaison d’IL-1β avec une énergie libre de liaison de −8,3 kcal/mol. De plus, l’acide euscaphique a interagi avec le site de liaison de NF-κB1 avec une énergie libre de liaison de −7,1 kcal/mol.
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3.2 Paramètres de la fonction cardiaque
La lésion cardiaque induite par l’ISO était caractérisée par une augmentation notable de CK-MB et de LDH par rapport au groupe témoin normal. À l’inverse, le traitement par l’extrait d’AV à dose élevée (AV200) ou faible (AV100) a entraîné une diminution considérable des niveaux sériques cardiaques de CK-MB et de LDH. Il est à noter que la dose plus élevée d’AV a modifié de façon marquée le niveau de CK-MB par rapport à la supplémentation par AV à faible dose.
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3.3 Dosage de la peroxydation lipidique cardiaque et des marqueurs antioxydants
L’ISO a déclenché une lésion oxydative substantielle et une peroxydation lipidique (LPO), comme illustré dans la figure 4. Une augmentation remarquable des niveaux cardiaques de MDA, accompagnée d’une diminution perceptible des activités enzymatiques de SOD et CAT et du niveau de GSH, a été observée chez les souris traitées par ISO par rapport aux autres groupes. Notamment, le stress oxydatif provoqué par l’ISO a été considérablement réduit par la supplémentation en AV, comme l’indique une diminution substantielle du niveau de MDA et une augmentation importante des indices GSH, SOD et CAT de manière dose-dépendante.
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3.4 Voie inflammatoire
Comme illustré dans la figure 5, les souris exposées à l’ISO ont présenté une inflammation cardiaque. Celle-ci a été expliquée par une augmentation marquée des niveaux de cytokines pro-inflammatoires (TNF-α et IL-1β), associée à une régulation positive des niveaux d’ARNm de NF-κB/P65 et des gènes liés à l’inflammation RAGE dans le groupe intoxiqué par ISO par rapport aux autres groupes. De façon remarquable, le prétraitement par AV100 et AV200 a montré des diminutions considérables de l’inflammation cardiaque induite par l’ISO selon un schéma dose-dépendant.
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3.5 Voies de l’autophagie et de l’apoptose
L’exposition à l’ISO a induit une apoptose cardiaque, comme l’indiquent les altérations de l’expression de l’ARNm des biomarqueurs apoptotiques et anti-apoptotiques. Comparée aux souris témoins, l’exposition à l’ISO a considérablement augmenté l’expression de Bax et induit une régulation négative considérable des niveaux d’expression génique de Bcl-2 (anti-apoptotique), indiquant une stimulation de la mort cellulaire apoptotique. D’autre part, nous avons observé une expression bien régulée de ces gènes dans le tissu cardiaque lorsque les souris exposées à l’ISO étaient prétraitées par AV (doses faibles ou élevées) selon un schéma dose-dépendant. Ensemble, ces résultats ont indiqué la promotion de la voie apoptotique avec l’exposition à l’ISO. En outre, l’exposition à l’ISO a induit une autophagie cardiaque, comme le montre la régulation positive de l’expression de l’ARNm de Beclin1 par rapport aux souris témoins. De plus, le traitement par AV a significativement modulé l’expression de Beclin1 de manière dose-réponse.
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3.6 Expression de HMGB1 et LC3 dans le tissu cardiaque
L’expression de HMBG1 et LC3 dans les sections de tissu cardiaque de souris exposées à l’ISO avec supplémentation en AV est présentée dans la figure 7. L’exposition à l’ISO a entraîné une régulation positive considérable de l’expression de HMBG1 et LC3 dans le tissu cardiaque (coloration brune positive proéminente des cardiomyocytes). En revanche, nous avons observé une expression modérée à minimale des deux protéines lorsque les souris étaient prétraitées par AV100 et AV200, respectivement. L’analyse semi-quantitative des sections positivement colorées dans les différents groupes de traitement a corroboré ces résultats. Par conséquent, les résultats ont révélé une amélioration de l’expression de HMBG1 et LC3 régulée positivement par l’ISO après le prétraitement par AV. De façon intéressante, la dose élevée d’AV (200 mg/kg) a réduit substantiellement les lésions cardiaques médiées par l’ISO et de manière dose-dépendante.
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3.7 Histoarchitecture cardiaque
Une évaluation histologique a été réalisée pour confirmer les résultats rapportés précédemment, qui évaluaient les altérations des sections de tissu cardiaque chez les souris exposées à l’ISO ayant reçu une supplémentation en AV. Les souris témoins ont montré une architecture normale du tissu cardiaque, comprenant une disposition normale des fibres musculaires, un motif ramifié allongé normal et des noyaux striés centraux ovales, comme montré dans la figure 8A. D’autre part, les souris exposées à l’ISO ont présenté des lésions cardiaques manifestes, comme l’indiquent diverses modifications dégénératives et nécrotiques des fibres myocardiques et des cardiomyocytes. Une dégranulation, une vacuolisation du cytoplasme et une infiltration cellulaire leucocytaire ont également été observées. Néanmoins, le prétraitement de l’ISO par AV100 a démontré une amélioration modérée des observations histologiques, indiquée par de légères modifications dégénératives dans presque toutes les sections de tissu cardiaque, avec peu de vacuolisation. De façon intéressante, l’architecture histologique myocardique a été presque complètement récupérée après la dose élevée d’AV (absence de modifications dégénératives myocardiques). Les observations histopathologiques ont corroboré les données biochimiques, indiquant que la préexposition à AV a montré un effet protecteur profond contre les lésions cardiaques infligées par l’ISO de manière dose-dépendante.
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3.8 Analyses multivariées
Des analyses multivariées ont été réalisées pour déterminer la corrélation entre les paramètres mesurés et les groupes de traitement, comme illustré dans la figure 9. L’analyse en composantes principales (ACP) a été utilisée pour étudier l’association entre les différents traitements et les covariables. L’ACP a distingué trois composantes dimensionnelles principales pour toutes les variables, qui représentaient collectivement 96,6% de la variation. La composante 1 discriminait la plupart des variables examinées et exprimait donc la plus grande proportion de variation (83,7%), tandis que les composantes 2 et 3 représentaient de plus petites proportions de la variance. L’ACP a révélé que le groupe exposé à l’ISO était clairement différent du groupe témoin et du groupe ISO + AV200. Ces observations ont élucidé une distinction significative entre les animaux prétraités par AV et ceux exposés à l’ISO.
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De plus, des réseaux de corrélation ont été construits entre les variables dans les groupes témoin et exposés. Beclin1 et NF-κB/p65 étaient positivement corrélés entre eux et avec RAGE, Bax, le rapport Bax-Bcl2 et MDA. Beclin1 et NF-κB/p65 étaient négativement corrélés avec Bcl-2. De plus, CK-MB était positivement corrélé avec RAGE, Beclin1 et IL-1β. En outre, la carte thermique de regroupement a fourni une visualisation intuitive de tous les ensembles de données. La carte thermique de regroupement a révélé une distinction notable entre les valeurs de concentration de toutes les variables évaluées après l’exposition à l’ISO par rapport aux autres groupes de traitement. Ces données ont démontré que les souris exposées à l’ISO présentaient des lésions plus importantes que les souris des autres groupes. D’autre part, l’intensité de la couleur des cellules avec le traitement par AV a révélé une densité de couleur intermédiaire pour toutes les variables mesurées, indiquant l’effet atténuant d’AV contre l’exposition à l’ISO.
Enfin, nous avons effectué une analyse de corrélation pour étudier la relation des niveaux de CK-MB avec les autres paramètres mesurés. La figure 9D représente les différents paramètres corrélés positivement ou négativement avec le niveau de CK-MB dans le tissu cardiaque. Toutes les variables mesurées avaient une forte corrélation positive avec le niveau de CK-MB, tandis que seuls GSH, SOD, CAT et Bcl-2 présentaient une corrélation négative.
4 Discussion
La présente étude in silico a exploré si l’ISO présentait une affinité de liaison avec la glutathion synthétase, CAT, SOD1, SOD2, SOD3 et Bcl-2, ce qui a révélé l’association des voies oxydative et apoptotique aux lésions cardiaques induites par l’ISO. De plus, les composés bioactifs d’AV ont présenté une affinité de liaison avec TNF-α, IL-1β, NF-κB1, Bax, RAGE et HMBG1, ce qui atteste d’activités antioxydantes, anti-inflammatoires et antiapoptotiques potentielles.
L’ISO est classé comme un agoniste β-adrénergique synthétique non sélectif. Il produit une cardiotoxicité significative, en particulier des lésions de type infarctus dans le myocarde. Plusieurs mécanismes ont été proposés dans la pathogenèse des lésions myocardiques induites par l’ISO, mais la production de ROS au cours de l’autoxydation des catécholamines est l’une des raisons causales les plus critiques. La quinone est produite lorsque l’ISO est oxydé, générant une gamme de radicaux libres qui provoquent la LPO et l’épuisement du système antioxydant cellulaire. Cette étude a fourni des preuves convaincantes que les ROS contribuaient aux conséquences toxiques du traitement par ISO, ce qui se manifeste par des réductions notables des niveaux de GSH et des activités enzymatiques de SOD et CAT dans les tissus cardiaques. La SOD constitue la première ligne de défense enzymatique dans les mitochondries et est responsable de la dismutation de l’O2•− généré en O2 et H2O2. En outre, la CAT accélère la dissolution de H2O2 en eau et O2, neutralisant les dommages oxydatifs. En cas d’épuisement de la CAT, des quantités substantielles de OH•, le radical réactif le plus puissant, sont générées à partir de H2O2 par la réaction de Fenton. Les molécules OH• détruisent drastiquement les membranes lipidiques, produisant une LPO et stimulant la production d’une autre substance nocive, le MDA. Le MDA lui-même peut perturber de façon marquée le potentiel membranaire des mitochondries et altérer les protéines cellulaires ainsi que l’intégrité de l’ADN, entraînant des dommages cellulaires substantiels. Notre étude a documenté une augmentation substantielle des niveaux de MDA, corroborant la possibilité de lésions membranaires dues à l’exposition à l’ISO.
Comme prévu, l’augmentation de la LPO a perturbé l’intégrité et la perméabilité membranaires des cardiomyocytes, libérant des enzymes cardiaques (CK-MB et LDH) dans le sang et élevant leurs niveaux. Ce résultat a été confirmé par notre analyse de corrélation, qui a révélé une corrélation positive robuste entre les niveaux de CK-MB et l’accumulation de MDA dans le muscle cardiaque. Nos marqueurs de stress oxydatif étaient cohérents avec des recherches antérieures qui ont rapporté une réduction des antioxydants cellulaires lors de l’exposition à l’ISO. En outre, le résultat mentionné ci-dessus était corrélé avec ceux de Sammeturi et al., qui ont corroboré la LPO et l’augmentation des niveaux de MDA après le traitement par ISO. La LPO accrue correspondait à nos observations histologiques, qui ont révélé des altérations dégénératives dans les cardiomyocytes et reflétaient vivement les observations biochimiques.
Des preuves croissantes ont révélé une corrélation robuste entre l’inflammation et le stress oxydatif. Par conséquent, nous suggérons que la voie inflammatoire est un mécanisme supplémentaire sous-jacent à la cardiotoxicité induite par l’ISO. L’augmentation de la production de ROS déclenche une cascade de signalisation cellulaire qui renforce l’expression des gènes pro-inflammatoires et libère des médiateurs inflammatoires, culminant en une inflammation accrue. Conformément aux résultats de cette étude, l’ISO augmente considérablement les niveaux cardiaques de cytokines pro-inflammatoires (IL-1β et TNF-α), ainsi qu’un immunomarquage accru de HMGB1. De plus, l’expression des gènes d’ARNm NF-κB/p65 et RAGE était régulée positivement. L’implication de l’axe HMGB1–RAGE dans la pathogenèse de la maladie cardiaque inflammatoire a récemment reçu une attention considérable. HMGB1 se lie à RAGE et aux récepteurs de type Toll en réponse à une lésion cellulaire, provoquant la libération de chimiokines et de cytokines inflammatoires. RAGE est un récepteur de membrane cellulaire exprimé dans les cardiomyocytes ; lors de la mort cellulaire, il peut être libéré passivement et sécrété activement dans l’espace extracellulaire.
La signalisation RAGE peut également provoquer une réaction inflammatoire en amplifiant diverses cascades cellulaires qui renforcent la libération de cytokines inflammatoires et favorisent l’activation de la voie NF-κB/p65, culminant en une réaction inflammatoire massive. NF-κB/p65 est un facteur de transcription régulé par l’oxydoréduction, inactif dans des conditions normales, mais qui, lorsqu’il est déclenché, entre dans le noyau et favorise les médiateurs pro-inflammatoires, notamment TNF-α, qui renforcent l’activation d’IL-6 et des molécules d’adhésion, encourageant les leucocytes à se rassembler dans la zone d’inflammation. Notre réseau de corrélation a confirmé davantage la relation robuste entre le stress oxydatif et l’inflammation avec les lésions cardiaques induites par l’ISO. En outre, notre évaluation histologique du tissu cardiaque a vérifié ces effets, comme l’indique une infiltration notable de cellules inflammatoires. Ces observations sont cohérentes avec des études précédentes ayant rapporté une expression accrue de ces marqueurs associés à l’inflammation dans le tissu cardiaque. En outre, Bangert et son groupe ont observé des augmentations considérables de l’expression de HMGB1 et RAGE dans des biopsies myocardiques de patients souffrant de myocardite aiguë.
Il a été documenté que le stress oxydatif mitochondrial déclenche de nombreuses voies de signalisation cellulaire, dont l’apoptose. L’apoptose est une mort cellulaire provoquée par l’initiation de programmes cellulaires spécifiques contrôlés par des mécanismes régulateurs complexes. Cependant, l’autophagie, voie de dégradation lysosomale, est responsable de la dégradation des organites et protéines dysfonctionnels et superflus, ce qui joue un rôle crucial dans la survie cellulaire et l’homéostasie. La relation entre apoptose et autophagie est compliquée, car l’équilibre entre autophagie et apoptose est essentiel à la survie cellulaire. L’apoptose est régulée par deux protéines cytoplasmiques, Bax pro-apoptotique et Bcl-2 anti-apoptotique. Dans l’apoptose, la protéine Bax déclenche la cascade des voies mitochondriales intrinsèques, conduisant finalement à la mort cellulaire. D’autre part, Bcl-2 prévient l’apoptose en supprimant les protéines Bax, limitant l’activation en aval des voies de la machinerie apoptotique. En accord avec ces données, notre étude a découvert une apoptose accrue, comme le montrent des niveaux d’expression d’ARNm de Bax nettement augmentés, parallèlement à une régulation négative de Bcl-2 dans le tissu myocardique du groupe traité par ISO par rapport au groupe témoin.
D’autre part, Beclin1 est le gène critique qui régule l’autophagie cardiaque et la formation des autophagosomes. Bcl-2 se lie à Beclin1, formant un complexe Beclin1/Bcl-2. Par conséquent, Beclin1 est séquestré et l’autophagie est supprimée. HMGB1, modulateur critique de l’autophagie, est transloqué du noyau vers le cytosol par une voie dépendante des ROS. Ensuite, il se lie à Beclin1 et encourage sa dissociation de Bcl-2, renforçant ainsi le flux autophagique. De plus, HMGB1 est sécrété passivement dans l’espace extracellulaire après la mort cellulaire et module l’activité autophagique cellulaire en se liant à RAGE. En outre, LC3 est un biomarqueur bien connu de l’activité autophagique, fortement corrélé à la biogenèse des autophagosomes. Notre étude a documenté un dysfonctionnement de l’autophagie, comme l’indiquent la régulation positive de l’expression de l’ARNm de Beclin1 ainsi qu’un immunomarquage exagéré des protéines LC3 et HMGB1 dans les myocytes après exposition à l’ISO. Conformément à nos données, El-Ashmawy et al. et Sun et al. ont rapporté une autophagie myocardique après traitement par ISO, expliquée par la surexpression du marqueur d’initiation LC3.
AV est largement utilisée dans les remèdes traditionnels à travers le monde en raison de ses effets anti-inflammatoires et immunomodulateurs bien connus, ainsi que de ses capacités antioxydantes. L’activité antioxydante d’AV est le principal mécanisme plausible sous-jacent à son action protectrice contre les lésions cardiaques. Cette étude a également révélé que le traitement par AV pouvait avoir un impact antioxydant robuste sur le stress oxydatif induit par l’ISO de manière dose-dépendante. La capacité protectrice d’AV à piéger les radicaux libres est attribuée à sa richesse en contenu polyphénolique total et en flavonoïdes, en particulier aux très fortes concentrations de tanins solubles et de saponines. Les groupes hydroxyle présents dans la structure chimique des composés phénoliques pourraient fournir des raisons critiques à leur capacité à fonctionner comme piégeurs de radicaux. De plus, la quercétine, l’un des composés phytochimiques d’AV, peut diminuer le risque d’artériosclérose en inhibant l’oxydation des lipoprotéines de basse densité, ce qui réduit les lésions cardiaques. De nombreuses publications convaincantes ont soutenu l’idée que la supplémentation en AV augmente l’efficacité des enzymes antioxydantes et atténue l’action de la LPO.
Notamment, les recherches en cours indiquent que le prétraitement par AV pourrait atténuer les lésions cardiaques déclenchées par l’ISO, comme le révèle l’amélioration considérable des biomarqueurs sériques cardiaques de manière dose-dépendante. L’abondance de composés renforçant le cœur dans AV, tels que la pédunculine, l’agrimoniine, la sanguine, la castalagine, la vescalagine, les acides gallique et chlorogénique, pourrait jouer un rôle critique dans ces actions. En outre, ces flavonoïdes ont été rapportés comme ayant des effets cardioprotecteurs.
Le travail actuel a également révélé une action immunomodulatrice dose-dépendante d’AV chez les souris exposées à l’ISO, expliquée par des altérations des niveaux d’expression des cytokines pro-inflammatoires et par la suppression de l’infiltration de cellules inflammatoires dans les tissus cardiaques. De façon intéressante, AV est une riche source d’ellagitanins qui ont une fonction cruciale dans l’atténuation de la réponse inflammatoire via la voie NF-κB/p65, inhibant ainsi la libération de cytokines pro-inflammatoires. Nos observations concordent avec d’autres rapports antérieurs. De plus, la supplémentation en AV a exercé un effet anti-apoptotique contre l’expression accrue de l’ARNm de Bax provoquée par l’ISO et contre la régulation négative de l’expression de l’ARNm de Bcl-2 dans les cardiomyocytes. En outre, les deux doses d’AV ont régulé négativement l’expression des protéines Beclin1 et LC3 et affecté l’autophagie cardiaque, ce qui constitue un mécanisme d’atténuation potentiel contre les lésions myocardiques déclenchées par l’ISO. La figure 10 met en évidence les voies moléculaires sous-jacentes à la fonction atténuante d’AV après l’exposition à l’ISO.
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5 Conclusion
Nos données ont élucidé l’effet atténuant potentiel d’AV sur les lésions cardiaques infligées par l’ISO. Cet effet était probablement dû aux attributs enrichis d’AV en matière d’antioxydation, de piégeage des ROS et d’anti-inflammation. Les souris prétraitées avec AV ont maintenu l’intégrité de l’architecture et de la fonction du tissu cardiaque. AV a exercé des améliorations notables des défenses antioxydantes du cœur en réduisant les niveaux de MDA et en augmentant les niveaux de GSH ainsi que les activités de SOD et CAT. Des diminutions notables de l’expression génique des cytokines pro-inflammatoires et de NF-κB/p65 ont été observées chez les souris traitées par AV. Le ciblage de la voie de signalisation HMGB1/RAGE a également contribué à l’action cardioprotectrice d’AV. En outre, AV a atténué la mort apoptotique et l’autophagie induites par l’ISO. Ainsi, nos données suggèrent que la supplémentation en AV est un traitement prometteur de la cardiotoxicité induite par l’ISO, qui agit de manière dose-dépendante.