Évaluation des activités antioxydantes et cytoprotectrices d’extraits éthanoliques d’Arnica montana L. et d’Artemisia absinthium L.
Référence : Chemistry Central Journal 2012. — PMC3472325 · DOI 10.1186/1752-153X-6-97 Type : étude in vitro · Plante : Arnica des montagnes · Propriété → Antioxydant Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Contexte
Arnica montana L. et Artemisia absinthium L. (Asteraceae) sont des plantes médicinales originaires des régions tempérées d’Europe, notamment de Roumanie, traditionnellement utilisées pour traiter les plaies cutanées, les ecchymoses et les contusions. Dans la présente étude, la composition chimique et l’activité antioxydante d’extraits éthanoliques d’A. montana et d’A. absinthium, ainsi que leur effet protecteur contre le stress oxydatif induit par H₂O₂ dans une lignée de cellules NCTC de type fibroblastique murin, ont été évalués.
Résultats
L’extrait d’A. absinthium a présenté une capacité antioxydante supérieure à celle de l’extrait d’A. montana, mesurée par la capacité antioxydante équivalente au Trolox, la capacité d’absorption des radicaux oxygénés et l’activité de piégeage du radical libre 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle, en corrélation avec sa teneur en flavonoïdes et en acides phénoliques. Les deux extraits végétaux ont eu des effets significatifs sur la croissance des cellules NCTC dans les plages de 10–100 mg/L pour A. montana et de 10–500 mg/L pour A. absinthium. Aux mêmes doses, ils ont également protégé les cellules fibroblastiques contre les dommages oxydatifs induits par le peroxyde d’hydrogène. La meilleure protection a été observée lors du prétraitement des cellules avec 10 mg/L d’A. montana et 10–300 mg/L d’A. absinthium, respectivement, selon les essais au rouge neutre et à la lactate déshydrogénase. En outre, le prétraitement des cellules par les extraits végétaux à ces concentrations a empêché les modifications morphologiques induites par le peroxyde d’hydrogène. L’analyse par cytométrie en flux a montré que le prétraitement par les extraits d’A. montana et d’A. absinthium rétablissait la proportion de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire.
Conclusions
Les extraits d’A. montana et d’A. absinthium, riches en flavonoïdes et en acides phénoliques, ont présenté une bonne activité antioxydante et un effet cytoprotecteur contre les dommages oxydatifs dans des cellules de type fibroblastique. Ces résultats apportent un fondement scientifique à l’utilisation traditionnelle d’A. montana et d’A. absinthium dans le traitement des affections cutanées.
Contexte
Le vieillissement, les affections cutanées, la polyarthrite rhumatoïde et l’athérosclérose sont causés par le stress oxydatif, qui survient lorsque la production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) — sous forme de radical hydroxyle, d’anion superoxyde, de radical peroxyle, d’oxygène singulet, de peroxyde d’hydrogène ou d’ozone — dépasse la capacité de protection antioxydante des cellules cibles. Les radicaux libres déclenchent une cascade de réactions d’oxydoréduction entraînant des modifications de la structure chimique de macromolécules biologiques telles que les protéines, les lipides et l’ADN, des perturbations du métabolisme des cellules humaines, voire des lésions tissulaires. La peau humaine est exposée à la fois à des facteurs externes, tels que les rayonnements, le tabagisme, les polluants, les solvants organiques et les pesticides, et aux ERO produites en interne par le métabolisme cellulaire normal, la respiration aérobie normale, les leucocytes polymorphonucléaires stimulés ou les macrophages, ce qui augmente le niveau de stress oxydatif. Ces conditions pourraient retarder la cicatrisation de lésions cutanées telles que les brûlures, les ulcères, les plaies et l’eczéma.
Les antioxydants synthétiques et naturels jouent un rôle particulièrement important pour maintenir le niveau de stress oxydatif sous le seuil critique dans l’organisme humain. Des études antérieures in vitro et in vivo ont fait état de la capacité antioxydante de plusieurs espèces de plantes médicinales, agissant au niveau cellulaire par stimulation de la croissance cellulaire ou stabilisation du potentiel membranaire, ou au niveau moléculaire par piégeage des ERO, inhibition de la peroxydation lipidique, etc. Ces rôles ont été attribués, en partie, à leurs constituants biologiquement actifs, tels que les vitamines liposolubles et hydrosolubles (respectivement E et C) et les substances polyphénoliques.
Arnica montana L. (arnica) et Artemisia absinthium L. (absinthe) sont deux plantes herbacées vivaces originaires des régions tempérées d’Europe, notamment de Roumanie. Elles appartiennent à la même famille, les Asteraceae, et à la même sous-famille, les Asteroideae, mais A. montana est largement répandue dans les régions montagneuses, tandis qu’A. absinthium pousse naturellement en bordure des champs ou sur les pentes rocheuses. Traditionnellement, les fleurs séchées d’arnica sont utilisées sous forme de teinture ou de pommade pour le traitement topique des ecchymoses, des contusions et des douleurs cutanées. Les parties aériennes de l’absinthe, une plante aromatique, sont employées dans des préparations liquides pour traiter les plaies cutanées, les furoncles, les bosses ou les ulcères. Malgré leur utilisation traditionnelle dans les affections cutanées, aucune étude n’a rapporté l’activité cytoprotectrice d’extraits d’arnica et d’absinthe dans une lignée de fibroblastes murins.
L’objectif de cette étude était d’examiner la composition chimique des deux espèces végétales ainsi que leurs activités antioxydantes et stimulatrices de la croissance des fibroblastes. La composition polyphénolique des extraits éthanoliques d’arnica et d’absinthe a été analysée par des essais spectrophotométriques et par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Leur activité antiradicalaire in vitro a été étudiée au moyen d’essais de capacité antioxydante équivalente au Trolox (TEAC), de capacité d’absorption des radicaux oxygénés (ORAC) et de piégeage du radical libre 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH). L’effet protecteur des deux extraits végétaux contre le stress oxydatif induit par le peroxyde d’hydrogène dans une lignée de cellules NCTC de type fibroblastique murin a été évalué par les méthodes au rouge neutre et à la lactate déshydrogénase (LDH), par microscopie optique et par cytométrie en flux.
Résultats
Composition chimique
Chaque plante a été extraite dans une solution éthanolique à 70 % (v/v), à température ambiante, pendant 8 h, avec des rendements d’extraction de 18,44 % (m/m) pour les fleurs d’arnica et de 14,28 % (m/m) pour les parties aériennes de l’absinthe (tableau 1). Les teneurs totales en composés de type acides phénoliques et flavonoïdes des deux extraits végétaux sont présentées dans le tableau 1. L’extrait d’absinthe présentait des teneurs totales en acides phénoliques et en flavonoïdes significativement plus élevées (p < 0,01) que l’extrait d’arnica.
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L’analyse HPLC de l’extrait d’arnica a révélé plusieurs pics, parmi lesquels 8 pics principaux prédominaient, aux temps de rétention de 2,232, 2,913, 14,386, 27,874, 28,919, 30,441, 31,416 et 32,443 min, tandis que l’extrait d’absinthe présentait 3 pics prédominants à 14,319, 31,343 et 33,570 min (voir fichier supplémentaire 1). Les composés des extraits végétaux ont été identifiés par comparaison avec des étalons de référence d’acides phénoliques et de flavonoïdes sur la base de leurs temps de rétention en HPLC (voir fichier supplémentaire 2). Ils ont été quantifiés par intégration des aires des pics et les résultats sont présentés dans le tableau 2. La teneur de chaque acide phénolique et flavonoïde analysé différait significativement (p < 0,01) entre les extraits d’arnica et d’absinthe. L’arnica présentait des teneurs élevées en quercétine, rutine, apigénine et acide chlorogénique, avec des valeurs respectives de 1,881, 1,186, 0,501 et 0,329 mg/g d’extrait sec, tandis que l’absinthe présentait des teneurs élevées en quercétine, lutéoline, apigénine et acide caféique, avec des valeurs respectives de 2,707, 0,677, 0,359 et 0,181 mg/g d’extrait sec.
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Activité antioxydante
L’activité antioxydante des extraits éthanoliques d’arnica et d’absinthe de Roumanie a été déterminée au moyen de trois systèmes d’essai complémentaires : les essais DPPH·, TEAC et ORAC. Comme le montre le tableau 3, les deux extraits végétaux ont présenté une activité significative de piégeage des radicaux libres. L’extrait d’absinthe a donné des valeurs plus élevées dans les essais TEAC et ORAC (respectivement 690,62 et 917,89 μmol d’équivalents Trolox/g d’extrait) que l’extrait d’arnica (respectivement 486,06 et 682,22 μmol d’équivalents Trolox/g d’extrait), en corrélation avec sa teneur en acides phénoliques et en flavonoïdes. La valeur de CI₅₀ calculée pour l’activité de piégeage du radical libre DPPH diminuait dans l’ordre suivant : A. montana L. (0,63 ± 0,07 mg/mL) > A. absinthium L. (0,57 ± 0,05 mg/mL) > Trolox (0,28 ± 0,01 mg/mL). Le Trolox est un dérivé hydrosoluble de la vitamine E et a été utilisé comme étalon en raison de sa forte activité antioxydante.
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Ces résultats ont montré que l’extrait d’absinthe présentait une capacité antioxydante 1,4 fois supérieure à celle de l’extrait d’arnica, ce qui était corrélé à une quantité d’acides phénoliques 1,8 fois supérieure dans l’absinthe et à une quantité de flavonoïdes environ 1,4 fois supérieure à celles de l’extrait d’arnica.
Influence des extraits végétaux sur la viabilité cellulaire
Afin d’exclure un éventuel effet cytotoxique des extraits d’arnica et d’absinthe, plusieurs concentrations (10–1 000 mg/L) ont été testées sur les cellules NCTC. Comme le montre la figure 1, le traitement des cellules pendant 24 h par chacune des concentrations d’extrait végétal a produit un effet dépendant de la dose sur les valeurs de viabilité cellulaire. Des valeurs élevées de viabilité cellulaire (supérieures à 80 %) ont été enregistrées pour des concentrations allant jusqu’à 100 mg/L d’extrait d’arnica et jusqu’à 500 mg/L d’extrait d’absinthe (figure 1A). Les concentrations supérieures ont perturbé la rétention du rouge neutre et la viabilité cellulaire a diminué significativement (p < 0,01), jusqu’à 30,46 %, par rapport au témoin négatif (100 %) (figure 1A).
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Nous avons également recherché la présence de l’enzyme cytosolique LDH dans le milieu de culture cellulaire en tant qu’indicateur de lésions de la membrane cellulaire. Les cellules traitées par 10–100 mg/L d’extrait d’arnica et 10–500 mg/L d’extrait d’absinthe ont libéré moins de 15 % de la LDH dans le milieu de culture (figure 1B). Des concentrations plus élevées d’extraits végétaux ont entraîné des lésions cellulaires et la valeur de la LDH libérée a augmenté jusqu’à 71,7 %, valeur significativement supérieure (p < 0,01) à celle du témoin négatif (5,5 %) (figure 1B).
Ces données ont permis de sélectionner la plage optimale de concentrations non cytotoxiques de chaque extrait végétal (jusqu’à 100 mg/L pour l’arnica et 500 mg/L pour l’absinthe), utilisée dans les expériences suivantes.
Effet des extraits végétaux sur le stress oxydatif induit par H₂O₂ dans les cellules NCTC
H₂O₂, précurseur de diverses ERO, a été choisi comme réactif oxydant dans cette étude. Différentes concentrations de H₂O₂ (20–500 μM) ont été utilisées afin de déterminer la dose appropriée. La dose de 50 μM de H₂O₂, qui réduisait la viabilité des fibroblastes à environ 50 %, a été utilisée dans les expériences suivantes. Les doses plus élevées ont fortement réduit la viabilité cellulaire, jusqu’à 11 % avec 500 μM de H₂O₂.
Afin d’évaluer la capacité des deux extraits végétaux à réduire le stress oxydatif dans les cellules traitées par H₂O₂, des expériences de cotraitement et de prétraitement ont été réalisées ; leurs résultats sont présentés dans la figure 2. La viabilité cellulaire, l’intégrité membranaire, la morphologie et le cycle cellulaire ont été étudiés. Le cotraitement avec 10–100 mg/L d’extrait d’arnica ou 100–500 mg/L d’extrait d’absinthe, simultanément avec H₂O₂, a donné des valeurs de viabilité similaires à celles du groupe traité par H₂O₂ (figure 2A). Seules les cellules traitées par 10 mg/L d’absinthe ont présenté une valeur de viabilité cellulaire significativement plus élevée (p < 0,05), d’environ 60 %, que celle du groupe traité par H₂O₂ (figure 2A). Les mesures de libération de LDH dans les groupes cotraités par les extraits d’arnica et d’absinthe ne différaient pas significativement de celles du groupe traité par H₂O₂ (p > 0,05), à l’exception du groupe recevant 10 mg/L d’absinthe, dans lequel elles étaient significativement plus faibles (p < 0,05) (figure 2C). En comparaison, le prétraitement des cellules NCTC par l’extrait d’arnica ou d’absinthe, à chacune des concentrations testées, a inversé de manière significative la cytotoxicité induite par H₂O₂. Les résultats de l’essai au rouge neutre ont indiqué une viabilité cellulaire comprise entre 75 et 88,9 %, significativement supérieure (p < 0,01) à celle du groupe traité par H₂O₂ (figure 2B). La meilleure protection cellulaire, exprimée par les valeurs de viabilité cellulaire, a été observée lors du prétraitement avec 10 mg/L d’arnica et 10–300 mg/L d’absinthe, respectivement. La libération de LDH dans le milieu de culture était significativement réduite (p < 0,01) lorsque les cellules NCTC étaient prétraitées par chacune des concentrations d’extraits d’arnica et d’absinthe, comparativement au groupe traité par H₂O₂ (figure 2D).
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L’analyse morphologique a été réalisée sur les cellules cotraitées et prétraitées avec chacune des concentrations d’extraits végétaux et 50 μM de H₂O₂. Les cellules traitées par H₂O₂ semblaient dégénérées et lysées (figure 2E, à gauche). De même, les cellules cotraitées par les extraits végétaux et H₂O₂ présentaient une morphologie cellulaire altérée et une densité cellulaire réduite, témoignant d’un effet délétère quelle que soit la concentration de l’extrait (figure 2E, au milieu et à droite). En revanche, les cellules non traitées (figure 2F, à gauche) et les cellules prétraitées par 10 mg/L d’arnica ou par des concentrations d’extrait d’absinthe allant jusqu’à 300 mg/L ne présentaient pas de modification morphologique (figure 2F, au milieu et à droite). Les cellules étaient réparties de manière homogène sur la plaque et présentaient la morphologie fusiforme caractéristique des fibroblastes normaux. Quelques cellules en mitose et aucun corps apoptotique ont été observés sur les plaques prétraitées, comme dans le groupe non traité.
La répartition du cycle cellulaire a été analysée après traitement de cellules lésées par H₂O₂ avec respectivement 10 mg/L d’arnica et 300 mg/L d’absinthe. Comme le montre la figure 3A, les cellules traitées par H₂O₂ présentaient un cycle altéré, arrêté aux phases G0/G1 et G2/M. Les résultats ont montré que la proportion de cellules en phase G0/G1 diminuait de 60,61 % dans le témoin non traité à 40 % dans les cellules traitées par H₂O₂ et que la proportion de cellules en phase G2/M augmentait de 12,62 % dans le témoin non traité à 47 % dans les cellules lésées (figure 3B).
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Le cotraitement des cellules NCTC par les extraits végétaux et le peroxyde d’hydrogène a entraîné une répartition des événements du cycle cellulaire similaire à celle des cellules traitées par H₂O₂ (figure 3A), et les valeurs de teneur en ADN différaient significativement (p < 0,01) de celles du témoin non traité (figure 3B). Le cotraitement par les extraits d’arnica et d’absinthe a donné des valeurs respectives de 33,20 % et 34,20 % d’ADN en phase G0/G1, et de 52,69 % et 51,61 % d’ADN en phase G2/M, proches de celles des cellules traitées par H₂O₂. En outre, lors du cotraitement, la proportion de cellules en phase S a diminué jusqu’à des valeurs similaires à celles des cellules traitées par H₂O₂ (12,40 %) (figure 3A, B).
À l’inverse, le prétraitement des cellules NCTC par les extraits végétaux a inversé de manière significative l’effet induit par H₂O₂ sur la répartition du cycle cellulaire (figure 3A). La teneur en ADN dans chaque phase ne différait pas significativement (p > 0,05) de celle du témoin non traité (60,61 % en phase G0/G1, 12,62 % en phase G2/M et 26,77 % en phase S) (figure 3B). Ces valeurs indiquaient le rôle protecteur des extraits d’arnica et d’absinthe dans les cellules NCTC prétraitées.
Tous ces résultats obtenus dans les expériences de culture cellulaire ont montré que le prétraitement par 10 mg/L d’arnica et 10–300 mg/L d’absinthe présentait le meilleur effet protecteur contre le stress oxydatif induit par H₂O₂.
Discussion
De nombreuses études antérieures ont examiné la relation entre l’activité antioxydante des produits végétaux et leur teneur en polyphénols. Les composés polyphénoliques sont des antioxydants très importants en raison de leurs groupes hydroxyle, qui confèrent aux produits végétaux la capacité de piéger les radicaux libres. Plusieurs méthodes sont employées pour évaluer l’activité antioxydante de différents produits végétaux en raison de la nature complexe des substances phytochimiques. Certaines méthodes, comme l’ORAC, reposent sur le transfert d’atomes d’hydrogène : l’antioxydant et le substrat entrent en compétition pour des radicaux peroxyles produits thermiquement par décomposition de composés azoïques. Les méthodes reposant sur le transfert d’électrons, telles que la TEAC, mesurent la capacité d’un antioxydant à réduire un oxydant dont la couleur change lors de sa réduction, proportionnellement à la concentration de l’antioxydant. L’essai de piégeage du radical libre DPPH repose sur un mécanisme réactionnel associant transfert d’électrons et transfert d’atomes d’hydrogène. Dans notre étude, les extraits éthanoliques d’arnica et d’absinthe, riches en acides phénoliques et en flavonoïdes, ont montré une bonne activité de piégeage des radicaux libres dans les essais TEAC, ORAC et DPPH. Une corrélation linéaire entre leur teneur en polyphénols et leurs activités antioxydantes ORAC et TEAC avait été démontrée auparavant. Cela concorde avec une étude antérieure montrant que l’activité antiradicalaire de l’absinthe, évaluée par spectroscopie de résonance paramagnétique électronique, était bien corrélée à sa forte teneur en composés polyphénoliques. L’ampleur de l’activité antioxydante des extraits végétaux doit faire l’objet d’analyses supplémentaires au moyen d’essais reposant sur d’autres mécanismes d’action, tels que l’inhibition d’enzymes et la chélation d’oligoéléments intervenant dans la production de radicaux libres.
Les plantes étudiées dans le présent travail sont utilisées pour traiter diverses maladies en médecine traditionnelle. A. montana L. est employée dans le traitement externe des lésions cutanées, de l’eczéma ou des inflammations tendineuses et articulaires. A. absinthium L. est employée en usage externe pour la cicatrisation des plaies et l’eczéma, et en usage interne pour le traitement des douleurs abdominales et des hémorroïdes. La production excessive d’ERO est responsable de plusieurs maladies, notamment des affections cutanées. Les agents pharmacologiques exerçant un effet modulateur sur les processus de stress oxydatif peuvent être suivis au niveau cellulaire. Dans la présente étude, un protocole expérimental in vitro a été conçu afin de léser des cellules de type fibroblastique en utilisant le peroxyde d’hydrogène comme réactif oxydant. Composé instable et hautement réactif, le peroxyde d’hydrogène est toxique pour les cellules et est connu pour induire, dans les fibroblastes diploïdes humains, un arrêt de croissance similaire à celui de la sénescence. Selon d’autres auteurs, de faibles concentrations de peroxyde d’hydrogène induisaient préférentiellement la mort cellulaire par apoptose.
La capacité des extraits éthanoliques d’A. montana et d’A. absinthium à inverser l’effet de H₂O₂ dans des cellules NCTC lésées a été testée au moyen de protocoles de cotraitement et de prétraitement. Nous avons utilisé le colorant vital rouge neutre et l’essai de la LDH pour évaluer l’effet des extraits végétaux sur la viabilité cellulaire, ainsi que la microscopie optique pour observer la morphologie cellulaire et la cytométrie en flux pour analyser le cycle cellulaire. Plusieurs études ont utilisé le bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) pour évaluer la viabilité cellulaire, mais Bruggisser et ses collaborateurs ont montré que les composés phénoliques des extraits végétaux réagissaient avec le MTT et qu’une réduction directe en formazan se produisait en l’absence de cellules. Le prétraitement par les extraits végétaux a induit une augmentation de 1,7 à 2 fois de la viabilité cellulaire, évaluée par l’essai au rouge neutre, par rapport au cotraitement correspondant par l’extrait végétal. L’enzyme cytosolique LDH est un marqueur in vitro de l’intégrité membranaire. Les quantités de LDH libérées après le prétraitement des cellules NCTC par l’arnica et l’absinthe étaient respectivement 1,35 à 1,6 fois inférieures à celles de l’expérience de cotraitement, ce qui indique leur application potentielle au traitement des lésions de la membrane cellulaire provoquées par les ERO. Les observations de la morphologie cellulaire ont démontré que les deux extraits végétaux pouvaient protéger les fibroblastes murins contre le stress oxydatif lorsqu’ils étaient ajoutés 24 h avant l’agression par H₂O₂ (figure 2F).
Le contrôle du cycle cellulaire est un processus fortement régulé qui met en jeu une cascade complexe d’événements. Il est supposé que H₂O₂ pourrait provoquer l’arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M par l’expression d’un inhibiteur de kinase dépendante des cyclines. Dans la présente étude, les cellules exposées à H₂O₂ ont subi un blocage partiel en phase G2/M causé par des dommages de l’ADN (figure 3). Les cellules cotraitées par les extraits végétaux et H₂O₂ ont présenté une augmentation de la proportion de cellules en phase G2/M. Une augmentation de la proportion de cellules en phase S a également été observée, ce qui pourrait être dû à des dommages de l’ADN mitochondrial dans les cellules fibroblastiques. Nos résultats indiquaient que les cellules NCTC cotraitées avaient subi des dommages oxydatifs et étaient bloquées dans la phase en cours du cycle cellulaire, comme les cellules traitées par H₂O₂. Il pourrait également être avancé que le cotraitement a induit une augmentation de la production d’ERO et des lésions cellulaires. Un résultat très intéressant de cette étude a été enregistré lors de l’analyse du cycle cellulaire des cellules NCTC prétraitées par chacun des extraits végétaux. Les données ont démontré que les extraits d’A. montana et d’A. absinthium protégeaient les cellules NCTC contre les dommages oxydatifs, favorisaient la prolifération cellulaire et ne provoquaient aucune altération du cycle cellulaire liée au stress oxydatif induit par H₂O₂.
Partie expérimentale
Produits chimiques
Une lignée de fibroblastes murins (NCTC clone 929) a été obtenue auprès de l’European Collection of Cell Cultures (Sigma-Aldrich, États-Unis), et tout le matériel destiné aux expériences sur cellules en culture a été acheté auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, États-Unis). Le kit CytoTox 96 pour l’activité de la lactate déshydrogénase (LDH) et la RNase provenaient de Promega (États-Unis). L’iodure de propidium (IP) a été acheté auprès de BD Biosciences Pharmingen (San Diego, Californie, États-Unis). Le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH), le peroxyde d’hydrogène (H₂O₂), l’acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique (Trolox) et le rouge neutre (RN) ont été achetés auprès de Merck (Allemagne). Le méthanol de qualité HPLC, l’acétonitrile, l’acide gallique, l’acide chlorogénique, l’acide caféique, l’acide p-coumarique, l’acide férulique, la rutine, la lutéoline, la quercétine, la myricétine et l’apigénine ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (États-Unis). Tous les autres réactifs de qualité analytique élevée destinés aux analyses biochimiques provenaient de Merck (Allemagne).
Préparation des extraits végétaux
Le matériel végétal utilisé dans la recherche était constitué de fleurs d’A. montana L. et de parties aériennes d’A. absinthium L., espèces provenant du département de Cluj, en Roumanie. Elles ont été identifiées et authentifiées par le Dr G. Coldea, département de taxonomie et d’écologie, Institut de recherche biologique de Cluj-Napoca, Roumanie. Des spécimens de référence d’A. montana L. (n° 647621) et d’A. absinthium L. (n° 637250) ont été déposés à l’herbier du jardin botanique de Cluj-Napoca, en Roumanie. Les plantes ont été séchées à l’air, à température ambiante et à l’abri de la lumière, puis réduites en poudre. Les matières sèches (75 g) ont été extraites dans un mélange éthanol/eau (70/30, v/v), selon un rapport matière/solvant de 1:10 (m/v), sur un agitateur (200 tr/min), à température ambiante, pendant 8 h. Les extraits ont été séparés des résidus de matière par filtration sur papier-filtre Whatman n° 1. Le solvant a été éliminé par évaporation jusqu’à siccité, in vacuo, à 40 °C, à l’aide d’un évaporateur rotatif (Heidolph VV Micro, Allemagne), puis les extraits ont été lyophilisés dans un lyophilisateur Christ Gamma 1–16 LSC (Allemagne). Les extraits secs ont été pesés et conservés à −20 °C jusqu’à leur utilisation. Le rendement en pourcentage a été exprimé par rapport à la masse sèche du matériel végétal. Pour les expériences de culture cellulaire, les extraits secs ont été dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), à pH 7,4.
Détermination de la teneur totale en composés phénoliques et en flavonoïdes
La teneur totale en composés phénoliques de chaque extrait végétal a été déterminée au moyen d’un essai de Folin-Ciocalteu légèrement modifié. L’échantillon d’extrait (150 μL) a été mélangé avec 750 μL de réactif de Folin-Ciocalteu, à température ambiante, pendant 5 min. Ensuite, 4 mL de carbonate de sodium à 15 % (m/m) ont été ajoutés et le volume a été porté à 15 mL avec de l’eau distillée. Le mélange a été maintenu à température ambiante pendant 30 min, puis l’absorbance a été mesurée à 765 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV/VIS (Jasco V650, Japon). Toutes les déterminations ont été réalisées en trois exemplaires. L’acide caféique a servi d’étalon pour la courbe d’étalonnage. Les valeurs de teneur totale en composés phénoliques ont été exprimées en milligrammes d’équivalents d’acide caféique par gramme d’extrait sec.
La teneur totale en flavonoïdes des extraits végétaux a été déterminée par une méthode colorimétrique. À 0,5 mL de chacune des solutions d’extrait végétal ont été ajoutés séparément 1,5 mL de méthanol, 0,1 mL de chlorure d’aluminium à 10 %, 0,1 mL d’acétate de sodium à 1 M et 2,8 mL d’eau distillée. Le mélange a été laissé à température ambiante pendant 30 min. L’absorbance a été mesurée à 415 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV/VIS (Jasco V650, Japon). Tous les échantillons ont été analysés en trois exemplaires. La quercétine a servi d’étalon pour la courbe d’étalonnage. La teneur en flavonoïdes a été exprimée en milligrammes d’équivalents de quercétine par gramme d’extrait sec.
Analyse HPLC
Les extraits végétaux ont été analysés sur une colonne en phase inverse Zorbax XDB C18 (dimensions de la colonne : Φ 4,6 × 150 mm) au moyen d’un système HPLC Agilent 1200 (Agilent, États-Unis) comprenant une pompe quaternaire, un échantillonneur automatique thermostaté et un détecteur à réseau de diodes. Une solution mère d’extrait végétal (1 mg/mL) a été préparée dans du méthanol et 20 μL d’échantillon ont été injectés. La phase mobile était constituée de la phase A (tampon d’acétate de sodium 2 mM, pH 3,05) et de la phase B (acétonitrile). La séparation chromatographique a été réalisée à un débit de 0,5 mL/min, comme suit : 0–30 min, 2–20 % de B dans A ; 30–40 min, 30 % de B dans A ; 40–55 min, 2 % de B dans A. L’identification des composés a été effectuée à partir du temps de rétention, à une longueur d’onde de 270 nm. La quantification des composés a été réalisée à partir de l’aire des pics, par comparaison avec des étalons authentiques d’acides phénoliques (acide gallique, acide chlorogénique, acide caféique, acide p-coumarique, acide férulique) et de flavonoïdes (rutine, lutéoline, quercétine, myricétine, apigénine). Trois expériences ont été réalisées.
Activité antioxydante
Activité de piégeage du radical libre DPPH
L’activité de piégeage des radicaux libres des extraits a été déterminée par une méthode colorimétrique utilisant le radical stable DPPH. En bref, différentes concentrations (10, 100, 300, 500 et 1 000 mg/L) de chaque extrait végétal éthanolique (150 μL) ont été mélangées avec 0,9 mL de tampon Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4, et 1,5 mL de solution méthanolique de DPPH (0,25 mM). Le mélange a été incubé dans l’obscurité, à température ambiante, pendant 20 min, puis l’absorbance a été mesurée à 517 nm par rapport à un blanc (solution méthanolique de DPPH) au moyen d’un spectrophotomètre UV/VIS (Jasco V650, Japon). L’activité antioxydante a été exprimée en pourcentage de piégeage du radical libre DPPH et calculée à l’aide de la formule suivante :
% de piégeage = (A_blanc − A_échantillon) / A_blanc × 100
où A_blanc est l’absorbance de la solution méthanolique de DPPH et A_échantillon l’absorbance de la solution de DPPH après ajout de l’échantillon.
Le Trolox a été utilisé comme témoin. Chaque expérience correspondait à des échantillons en trois exemplaires. La concentration d’échantillon inhibant 50 % des radicaux libres DPPH (CI₅₀, mg/mL) a été déterminée graphiquement à partir de la courbe de régression linéaire représentant le pourcentage d’inhibition en fonction de la concentration de l’extrait.
Essai TEAC
La capacité antioxydante a été mesurée selon la méthode de Re et ses collaborateurs, avec quelques modifications. En bref, le cation radicalaire ABTS a été produit en mélangeant une solution mère à 7 mM de sel diammonique de l’acide 2,2’-azino-bis(3-éthyl-benzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS) avec du persulfate de potassium à 2,45 mM (1:1, v/v), puis en incubant le mélange pendant 12–16 h dans l’obscurité, à température ambiante, jusqu’à ce que la réaction soit complète et l’absorbance stable. Après dilution avec de l’eau bidistillée, l’absorbance de la solution de radical ABTS a été ajustée à 0,70 ± 0,02 à 734 nm. Ensuite, 1 mL de réactif a été mélangé avec 100 μL d’échantillon d’essai (0,05–1 mg/mL), puis l’absorbance a été mesurée après 6 min, à 734 nm, à l’aide d’un spectrophotomètre UV/VIS (Jasco V 650, Japon). Les données ont été enregistrées en trois exemplaires. Le Trolox a été utilisé comme étalon, dans une plage de concentrations de 0–250 μM, afin d’établir une courbe d’étalonnage, et la capacité antioxydante a été calculée en micromoles d’équivalents Trolox (ET) par gramme d’extrait.
Essai ORAC
L’essai ORAC a été réalisé comme décrit précédemment par Ou et ses collaborateurs, avec quelques modifications. En bref, le mélange réactionnel a été préparé en ajoutant 50 μL de fluorescéine à 0,42 μM à 100 μL d’extrait et 1,8 mL de tampon phosphate, pH 7,3. Ce mélange a été incubé à 37 °C pendant 15 min. Ensuite, 50 μL de dichlorhydrate de 2,2’-azobis[2-méthyl-propionamidine] (AAPH) à 640 mM ont été ajoutés comme générateur de radicaux peroxyles. Les échantillons et la solution étalon de Trolox ont été préparés quotidiennement. L’intensité relative de fluorescence a été suivie toutes les 0,004 min pendant 80 min sur un spectromètre Perkin Elmer LS 55 équipé de filtres de fluorescence (excitation à 489 nm, émission à 515 nm). Tous les essais ont été réalisés en trois exemplaires et les valeurs moyennées. Les résultats, exprimés en micromoles d’équivalents Trolox (ET) par gramme d’extrait, ont été calculés selon la formule suivante :
μmol ET = C_Trolox · k · (ASC_échantillon − ASC_blanc) / (ASC_Trolox − ASC_blanc)
où C_Trolox est la concentration de Trolox, k le facteur de dilution de l’échantillon et ASC l’aire sous la courbe de décroissance de la fluorescence pour l’échantillon, le blanc et le Trolox, respectivement.
Essais in vitro sur la culture de cellules NCTC
Culture cellulaire et expérience de cytotoxicité
Les fibroblastes murins (NCTC clone 929) ont été cultivés dans du milieu essentiel minimum (MEM) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (SBF), 100 U/mL de pénicilline, 100 mg/L de streptomycine et 500 mg/L de néomycine. Les cellules confluentes ont été trypsinées, centrifugées et repiquées dans le même milieu, sous une atmosphère humidifiée composée de 5 % de CO₂ et de 95 % d’air, à 37 °C. Pour les expériences, les suspensions cellulaires ont été ensemencées à une densité de 5 × 10⁴ cellules/puits dans des plaques de culture à 24 puits, puis laissées adhérer par culture dans du MEM contenant 10 % de SBF et incubation sous une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂, à 37 °C, pendant 24 h. Le milieu de culture a ensuite été remplacé par le même milieu contenant différentes concentrations d’extrait végétal (10, 100, 300, 500 et 1 000 mg/L), et les cellules ont été cultivées dans les conditions standard pendant 24 h. La viabilité cellulaire a été évaluée par l’essai au rouge neutre et l’intégrité cellulaire par l’essai de la LDH. Des cellules non traitées et des cellules cultivées en présence de 100 μM de H₂O₂ ont servi de témoins. Trois expériences distinctes ont été réalisées.
Essai au rouge neutre
La cytotoxicité des extraits végétaux a été évaluée selon la méthode au rouge neutre décrite précédemment, avec quelques modifications. En bref, 24 h après le traitement par H₂O₂, les milieux de culture ont été remplacés par une solution de RN (50 mg/L) dans du MEM et les cellules ont été incubées à 37 °C pendant 3 h. Les fibroblastes ont ensuite été lavés et le RN retenu a été dissous à l’aide d’acide acétique à 1 % (v/v) dans de l’éthanol à 50 % (v/v). Les plaques ont été incubées sur un agitateur pendant 15 min et l’absorbance a été mesurée à 540 nm sur un lecteur de microplaques (Sunrise Tecan, Autriche). Les résultats, exprimés sous forme de moyenne de six déterminations ± écart-type (ET), ont été rapportés en pourcentage du témoin constitué de cellules non traitées, considéré comme représentant 100 % de cellules viables.
Essai de l’activité de la LDH
L’activité de la LDH, indicatrice de lésions de la membrane cellulaire, a été mesurée à l’aide du kit CytoTox 96 conformément au protocole du fabricant. En bref, le milieu de culture et les lysats cellulaires recueillis après les expériences en milieu sans sérum ont été centrifugés, puis une aliquote de 50 μL du surnageant a été incubée avec 50 μL de solutions réactionnelles mélangées, à température ambiante, pendant 30 min. L’absorbance a été mesurée à 490 nm au moyen d’un lecteur de plaques à 96 puits (Sunrise Tecan, Autriche). L’intensité de la couleur est proportionnelle à l’activité de la LDH. Les résultats ont été calculés comme suit :
LDH libérée (%) = LDHmilieu / LDHmilieu + lysat cellulaire × 100
où LDH_milieu est l’activité de la LDH dans le milieu de culture et LDH_milieu + lysat cellulaire l’activité de la LDH dans le milieu de culture et le lysat cellulaire. Les données ont été exprimées sous forme de moyenne de six déterminations ± ET.
Stress oxydatif induit par H₂O₂ dans la culture cellulaire et traitement par les extraits végétaux
Afin d’établir la concentration de H₂O₂ provoquant des lésions cellulaires récupérables (environ 50 %), les cellules ont été traitées par plusieurs concentrations de H₂O₂ (20, 50, 100 et 500 μM) pendant 24 h. La viabilité cellulaire a été évaluée par l’essai au rouge neutre.
Pour évaluer l’effet cytoprotecteur des extraits végétaux, les cellules ont été ensemencées dans des plaques de culture à 24 puits à une densité de 5 × 10⁴ cellules/puits, puis laissées adhérer pendant 24 h par incubation dans du MEM contenant 10 % de SBF, sous une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂, à 37 °C. Deux groupes de traitement ont été conçus : des cellules traitées simultanément par l’extrait végétal et H₂O₂ (cotraitement), et des cellules traitées par différentes concentrations d’extraits végétaux pendant 24 h, puis exposées à H₂O₂ (prétraitement). Les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 24 h, puis les cellules des deux groupes ont été analysées quant à leur viabilité par les essais au rouge neutre et à la LDH, quant à leur morphologie par observation en microscopie optique et quant au cycle cellulaire par cytométrie en flux. Des cellules non traitées et des cellules traitées par H₂O₂, cultivées dans les mêmes conditions, ont servi de témoins dans cette expérience. Trois essais indépendants ont été réalisés.
Microscopie optique
Les cellules cultivées ont été fixées dans du méthanol et colorées au Giemsa. Les cultures ont été photographiées à l’aide d’un microscope Zeiss AxioStar Plus équipé d’un appareil photo numérique piloté par le logiciel AxioVision 4.6 (Carl Zeiss, Allemagne).
Analyse par cytométrie en flux de la teneur en ADN et de la répartition du cycle cellulaire
La teneur en ADN et la répartition du cycle cellulaire ont été évaluées par coloration à l’iodure de propidium (IP), comme décrit précédemment. En bref, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits, à une densité de 2 × 10⁵ cellules/puits, puis incubées dans du MEM supplémenté avec 10 % de SBF pendant 24 h. Les cellules ont été traitées par les extraits végétaux et/ou H₂O₂ comme indiqué dans les protocoles de cotraitement et de prétraitement. Après traitement, les cellules ont été recueillies avec 0,02 % de trypsine et 0,2 % d’EDTA, rincées avec du PBS (5 min), puis fixées dans de l’éthanol à 70 %, à 4 °C, pendant 24 h. Les cellules, lavées deux fois avec du PBS (5 min), ont été incubées dans 0,5 mL d’une solution de RNase à 0,5 mg/mL, à 37 °C, pendant 30 min. Après rinçage, les cellules ont été incubées dans une solution d’IP à 50 mg/L dans du PBS, à 4 °C, pendant 30 min, puis analysées sur un cytomètre en flux LSR II (Becton Dickinson, États-Unis). Le logiciel MODFIT™ LT 3.0 a été utilisé pour décomposer les histogrammes de teneur cellulaire en ADN afin d’obtenir le pourcentage de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire (G0/G1, G2/M et S). Des cellules non traitées et des cellules traitées par H₂O₂ ont servi de témoins. Trois expériences distinctes ont été réalisées.
Analyse statistique
Pour chaque échantillon, des analyses chimiques en trois exemplaires et trois expériences en double pour les études de culture cellulaire ont été réalisées. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET. La comparaison par paires du témoin et de chaque échantillon a été effectuée au moyen du test t. Les différences statistiques ont été considérées comme significatives à p < 0,05 (#p < 0,05, p < 0,01 par rapport au témoin non traité ; *p < 0,05, **p < 0,01 par rapport au groupe traité par H₂O₂).
Conclusions
En conclusion, nos données ont démontré que les extraits éthanoliques d’A. montana et d’A. absinthium présentaient des teneurs élevées en acides phénoliques et en flavonoïdes, une bonne activité antioxydante et une cytocompatibilité dans la lignée cellulaire NCTC, à des concentrations allant respectivement jusqu’à 100 mg/L et 500 mg/L. Les deux extraits végétaux exerçaient un effet protecteur sur les fibroblastes contre le stress oxydatif induit par le peroxyde d’hydrogène dans les cellules en culture. Sur la base de ces résultats, nous considérons que l’utilisation traditionnelle de l’arnica et de l’absinthe dans le traitement des affections cutanées pourrait s’expliquer par leurs activités antioxydantes et cytoprotectrices. Des études supplémentaires détermineront quels composés de ces extraits végétaux sont responsables de leurs propriétés protectrices.
Intérêts concurrents
Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêts concurrents.
Contributions des auteurs
OC a participé à la mesure de l’activité de piégeage des radicaux, à l’interprétation des données et à l’analyse statistique, et a contribué à la rédaction du manuscrit. DC et LT ont réalisé les essais in vitro et la cytométrie en flux sur la culture de cellules NCTC, acquis les données et procédé à leur analyse. AG et EU ont produit les échantillons, déterminé les composés phénoliques totaux, réalisé la HPLC et mesuré l’activité de piégeage des radicaux, puis procédé à l’analyse des données. LM a conçu l’étude, participé à la conception et à la coordination des expériences ainsi qu’à l’interprétation des données, et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.
Matériel supplémentaire
Fichier supplémentaire 1
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Fichier supplémentaire 2
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Remerciements
Ce travail a été soutenu par le projet roumain BIODIV et par l’UEFISCDI — projet n° 62059 dans le cadre du programme roumain de recherche 4 « Partenariat dans les domaines prioritaires des sciences et technologies ».