Optimisation de l’extraction supercritique d’Arnica montana L. pour une activité antibiotique et anticancéreuse
Référence : Frontiers in Bioengineering and Biotechnology 2022. — PMC9127360 · DOI 10.3389/fbioe.2022.897185 Type : étude expérimentale in vitro et optimisation d’extraction · Plante : Arnica des montagnes · Propriété → Cancer Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Les capitules d’Arnica montana L. sont connus pour leurs activités antioxydante, antimicrobienne et anticancéreuse. L’objectif de ce travail était d’optimiser le procédé d’extraction par CO₂ supercritique afin d’obtenir un rendement d’extraction élevé et une teneur élevée en composants biologiquement actifs, et de confirmer l’activité antimicrobienne et anticancéreuse de l’extrait. L’influence de la pression et de la température sur la teneur totale en composés phénoliques, l’activité antioxydante et la teneur en proanthocyanidines a été évaluée. Il a été constaté que la pression et la température étaient interdépendantes. Une température de 60 °C et une pression de 30 MPa ont permis d’obtenir un rendement d’extraction, une activité antioxydante et une teneur en composés phénoliques élevés. La teneur en proanthocyanidines était la plus élevée à une pression comprise entre 18 et 24 MPa. Les extraits ont inhibé efficacement trois micro-organismes différents, Staphylococcus aureus, Escherichia coli et Candida albicans, à des concentrations allant de 0,1 à 5,16 mg/ml, et ont montré une activité anticancéreuse, avec une diminution allant jusqu’à 85 % à une concentration de 0,5 mg/ml.
1 Introduction
Arnica montana est une espèce végétale protégée largement utilisée en médecine traditionnelle et moderne pour ses propriétés antibactériennes, antitumorales, antioxydantes, anti-inflammatoires et antifongiques. Le genre compte plus de 30 espèces différentes, qui diffèrent sensiblement par leur teneur en composants médicinaux ; A. montana est l’espèce la plus largement utilisée pour sa valeur médicinale et les capitules sont la partie de la plante qui contient les teneurs les plus élevées en composés biologiquement actifs. L’activité antimicrobienne des extraits de la plante a été étudiée de manière approfondie, car il a été démontré qu’ils possèdent une activité antimicrobienne contre un large éventail de micro-organismes. L’activité anticancéreuse de divers composants d’A. montana a fait l’objet d’études approfondies, en particulier celle des lactones sesquiterpéniques, principaux composés actifs de la plante. Il a été démontré que les huiles essentielles de la plante possèdent une activité cytotoxique sur les cellules d’astrocytome anaplasique et de glioblastome multiforme, tandis que les extraits éthanoliques de la plante inhibaient également la mélanogenèse. L’arnica contient plus de 150 composés thérapeutiquement actifs et, lors de notre recherche bibliographique, nous n’avons trouvé aucune donnée publiée sur l’effet des extraits de la plante sur l’activité métabolique des cellules cancéreuses.
Afin de préparer des extraits de matières végétales avec des solvants naturels et sûrs, l’extraction supercritique (SCF) au dioxyde de carbone (CO₂) a été choisie comme méthode d’extraction. Dans de nombreuses études, cette méthode a été présentée comme une technique novatrice permettant d’obtenir des huiles essentielles de haute qualité avec une perte minimale de leurs composants, préservant ainsi très bien leurs propriétés antimicrobiennes. En outre, il a été constaté que l’extrait au CO₂ supercritique contenait des teneurs élevées en constituants actifs, les sesquiterpènes, et qu’il était stable dans des préparations semi-solides. Cette technique constitue également un procédé respectueux de l’environnement susceptible de remplacer de nombreux solvants organiques nocifs pour l’environnement ou potentiellement dangereux. Elle devient rentable à l’échelle de la production et est souvent utilisée pour extraire des matières naturelles pouvant être employées dans les industries alimentaire, pharmaceutique et cosmétique.
Les industries pharmaceutique et cosmétique ont constamment besoin de nouvelles formulations et de nouveaux principes actifs. Les extraits de matières naturelles représentent une riche source de composants bioactifs utilisables dans diverses applications. Cependant, la littérature mentionne des différences importantes entre les extraits naturels d’une même matière obtenus au moyen de méthodes, de conditions et de solvants d’extraction différents. Même au sein d’une même espèce, les extraits varient considérablement en raison de facteurs environnementaux et génétiques. Il est donc recommandé d’étudier les différences entre les extraits issus de différentes sources de matière et obtenus dans différentes conditions d’extraction.
L’objectif de cette étude était de déterminer les conditions optimales (température et pression) de l’extraction SCF afin d’obtenir une efficacité d’extraction et une teneur en composants actifs (antioxydants, composés phénoliques totaux et proanthocyanidines) maximales. La qualité de l’extrait a été évaluée par la détermination de la teneur en composants biologiquement actifs (activité antioxydante, composés phénoliques et proanthocyanidines), et ceux qui en présentaient la proportion la plus élevée ont fait l’objet de tests supplémentaires portant sur leur activité antimicrobienne. L’extrait présentant l’activité antioxydante la plus élevée a été soumis à un essai d’activité cytotoxique sur des cellules de mélanome. Cette étude décrit l’effet de la température et de la pression sur l’extraction de l’arnica par fluide supercritique. Les conditions optimales d’extraction ont été déterminées en fonction du rendement en composés biologiquement actifs dans l’extrait.
2 Matériel et méthodes
L’Arnica montana a été acheté auprès d’Alfred Galke (Samtgemeinde Bad Grund, Allemagne). Les matières ont été fournies séchées. La matière séchée a été broyée, puis extraite. L’extrait a été conservé au congélateur jusqu’à son utilisation pour les analyses. Toutes les analyses ont été effectuées dans un délai de 1 mois.
2.1 Plan expérimental Design-Expert
Le procédé d’extraction a été conçu et optimisé à l’aide de Design-Expert Pro 12 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis). Deux facteurs indépendants, à savoir une température comprise entre 35 et 64 °C et une pression comprise entre 5,8 et 34,1 MPa, ont été sélectionnés pour le plan expérimental. Le tableau 1 présente la matrice expérimentale des extractions supercritiques d’A. montana.
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2.2 Extractions par fluide supercritique
Les extractions ont été réalisées dans un système SFE, comme décrit précédemment. La matière séchée constituée de capitules mélangés (43 g) a été placée dans un autoclave d’un volume d’environ 1 000 ml. La SFE a été réalisée dans diverses conditions déterminées par le logiciel Design-Expert et présentées dans le plan expérimental (tableau 1). Les paramètres expérimentaux couvraient une plage de pressions allant de 6 à 34 MPa et de températures allant de 35 à 65 °C. Le débit du solvant et la quantité de CO₂ supercritique consommée étaient constants dans toutes les expériences. Une pompe à haute pression, un réchauffeur, un autoclave (produit par la société UHDE-GmbH-Hagen BRD) et un séparateur ont été utilisés pour le procédé. Après le procédé, l’extrait a été conservé au congélateur jusqu’à l’analyse.
2.3 Analyses spectrophotométriques
Des analyses spectrophotométriques dans l’ultraviolet ont été effectuées sur les extraits afin de déterminer leur activité antioxydante ainsi que leurs teneurs en composés phénoliques totaux et en proanthocyanidines. Un appareil UV-VIS (BIOTEK SYNEGRY 2) a été utilisé pour les analyses.
2.3.1 Détermination de l’activité antioxydante
L’activité antioxydante (AA) a été déterminée par la méthode au 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle (DPPH), comme décrit précédemment. En bref, 10 mg d’extrait ont été pesés dans une fiole jaugée de 10 ml, puis du méthanol a été ajouté. La solution a été mélangée et entièrement dissoute dans un bain à ultrasons. Un volume de 3 ml de solution de DPPH et 77 μl de solution d’extrait ont été mélangés et thermostatés pendant 15 min à température ambiante. L’absorbance a été mesurée à 515 nm.
2.3.2 Détermination des composés phénoliques totaux
Les composés phénoliques totaux ont été déterminés à l’aide d’un réactif FC (Folin-Ciocalteu), comme décrit précédemment. En bref, 0,5 ml d’extrait dilué ont été ajoutés à 2,5 ml de réactif FC dilué au dixième avec de l’eau distillée, puis 2 ml de Na₂CO₃ (75 g/L) ont été ajoutés. Le témoin a été préparé avec 0,5 ml d’eau distillée. Une courbe d’étalonnage a été préparée avec de l’acide gallique dilué dans de l’eau distillée. Les flacons en verre ont été thermostatés à 50 °C pendant 5 min. L’absorbance des solutions refroidies a été mesurée à 760 nm. La teneur totale en composés phénoliques a été exprimée en mg de GA par g d’extrait.
2.3.3 Détermination des proanthocyanidines
La teneur en proanthocyanidines a été déterminée à l’aide de sulfate de fer(II) heptahydraté, d’acide chlorhydrique et de butanol, comme décrit précédemment. En bref, 77 mg de [Fe(SO₄) × 7H₂O] ont été pesés dans une fiole jaugée de 500 ml, puis 500 ml d’un mélange de HCl et de butanol selon un rapport 2:3 ont été ajoutés. L’extrait a été dilué avec de l’eau distillée. Un volume de 10 ml de solution de sulfate de fer(II) heptahydraté a été ajouté dans le flacon en verre, mélangé et thermostaté dans un bain-marie à T = 95 °C pendant 15 min. L’absorbance des échantillons refroidis a été mesurée à une longueur d’onde de 540 nm. La teneur en proanthocyanidines a été exprimée en mg de PAC par g d’extrait.
2.4 Activité antimicrobienne des extraits
L’activité antimicrobienne a été déterminée pour les extraits présentant une teneur élevée en composants biologiquement actifs. L’activité antimicrobienne in vitro des extraits a été testée contre Staphylococcus aureus (MRSA) (ATCC 25923, ATCC, Wesel, Allemagne), Escherichia coli (ATCC 25922, ATCC, Wesel, Allemagne) et Candida albicans (ATCC 60193, ATCC, Wesel, Allemagne) à l’aide de la méthode de microdilution en bouillon. Un bouillon MH ajusté en cations, supplémenté en sang de cheval lysé et en β-NAD (bouillon MH-F), a été utilisé comme décrit précédemment. Une plaque de microtitration à 96 puits a été remplie avec 100 μl de bouillon MH et 100 μl d’extrait soumis à des dilutions successives. La concentration de l’extrait allait de 18,750 mg/L à 0,037 mg/L. Le témoin positif contenait 50 μl de bouillon MH et 50 μl d’extrait dilué. Le témoin négatif contenait 100 μl de bouillon MH et 10 μl du micro-organisme (densité de l’inoculum de 10⁸ UFC/ml). Après 24 h d’incubation à 37 °C, 30 μl d’une solution stérile de résazurine à 0,04 % ont été ajoutés à chaque échantillon, puis ceux-ci ont été incubés pendant 4 h supplémentaires. En présence d’une croissance bactérienne, les échantillons viraient du bleu foncé au rose. Le critère de détermination de la CMI était la plus faible concentration de substance entraînant une réduction de la croissance d’au moins 90 % par rapport au témoin négatif. Tous les essais ont été réalisés en cinq exemplaires.
2.5 Activité anticancéreuse des extraits sur les cellules de mélanome et apoptose cellulaire
L’activité cytotoxique in vitro des extraits présentant la teneur la plus élevée en composants biologiquement actifs a été testée contre des cellules WM266-4 de mélanome cutané métastatique. Les cellules ont été cultivées dans un milieu complet de composition suivante : 98,8 % de milieu essentiel minimum d’Eagle (EMEM), 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 0,2 % de MycoZap Plus-CL 500x. Les cellules cancéreuses, à une densité de 1 × 10⁴ cellules viables par puits, ont été incubées pendant 24 h dans une plaque de culture à 96 puits afin de permettre leur adhésion. Les cellules ont ensuite été exposées aux extraits d’A. montana (c = 5 ; 4 ; 3 ; 2 ; 1 ; 0,5 ; 0,25 ; 0,1 ; 0,05 ; 0,01 mg/ml) pendant 24 h. Les cellules témoins ont été incubées dans le milieu sans ajout d’extrait. L’activité métabolique des cellules a été mesurée par spectrophotométrie au moyen d’un kit colorimétrique de viabilité cellulaire (WST 8, PromoKine, PromoCell, Heidelberg, Allemagne, UE). L’absorbance a été mesurée à 570 nm (absorbance de fond à 630 nm) en cinq exemplaires. L’activité métabolique (MA) des cellules a été calculée à l’aide de l’équation suivante :
%MA = [(A₅₇₀ − A₆₃₀) échantillon testé / (A₅₇₀ − A₆₃₀) témoin] × 100
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où A est l’absorbance moyenne calculée à partir des cinq exemplaires. La morphologie des cellules avant et après leur exposition à l’extrait a été observée à l’aide d’un microscope inversé (DFC365 FX Leica, Buffalo Grove, Illinois, États-Unis).
Un analyseur cellulaire Muse et un kit Muse Annexin V and Dead Cell (Luminex, Commercial Ave, Northbrook, Illinois) ont été utilisés pour examiner l’apoptose. L’apoptose a été vérifiée conformément au protocole prescrit par le fabricant pour le kit Muse Annexin V and Dead Cell, numéro de catalogue MCH100105. Après trypsinisation des cellules, les suspensions cellulaires ont été préparées pour l’analyse. En bref, le réactif Annexin V and Dead Cell a été ajouté à chaque échantillon, puis mélangé. Les échantillons ont été analysés à l’aide de l’analyseur cellulaire Muse. Chaque expérience a été réalisée en cinq exemplaires et la valeur moyenne a été déterminée.
3 Résultats et discussion
3.1 Extractions par fluide supercritique
L’extraction par fluide supercritique (SFE) a été choisie comme méthode d’extraction, car elle garantit une extraction efficace et rapide, ne nécessite que des températures modérées, supprime la nécessité de procédés de purification et évite l’utilisation de solvants organiques nocifs. Le CO₂ est le solvant le plus largement utilisé, car il est non explosif, non toxique, facilement accessible et facile à séparer des produits extraits. Les conditions d’extraction et l’équipement utilisés dans cette étude sont similaires à ceux récemment employés dans des installations industrielles pour isoler des composés actifs. À partir des rendements d’extraction obtenus, une équation quadratique a été ajustée pour calculer l’efficacité des extractions supercritiques, avec des limites inférieures de 10 MPa et 40 °C et des limites supérieures de 30 MPa et 60 °C.
μ_extraction = −3,64795 + 0,236261 · T − 0,001491 · p + 0,000530 · T · p − 0,003544 · T² − 0,000038 · p²
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où μ_extraction est le rendement d’extraction, T la température à laquelle l’extraction a lieu (°C) et p la pression d’extraction (bar). L’équation montre que la température et la pression sont liées. Le modèle est significatif (F = 70,29, p < 0,0001). Le coefficient de Pearson au carré prédit (R² préd.) a une valeur de 0,8611, ce qui est acceptable par rapport au R² ajusté (R² aj.) de 0,9665, car leur différence est inférieure à 0,2.
La figure 1A montre que la pression est un paramètre légèrement plus important que la température pour obtenir des efficacités d’extraction supérieures. Plus la pression et la température sont élevées, plus l’efficacité d’extraction est élevée. Les efficacités d’extraction les plus élevées ont été obtenues à une pression supérieure à 30 MPa et à une température supérieure à 50 °C (rendement = 3,5 %).
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L’activité antioxydante des extraits obtenus est présentée à la figure 1B. À l’aide du logiciel Design-Expert, une équation quadratique a été ajustée pour calculer les antioxydants présents dans les extraits, avec des limites inférieures de 10 MPa et 40 °C et des limites supérieures de 30 MPa et 60 °C.
AA = 61,54390 + 0,102695 · T − 0,106778 · p + 0,000392 · p²
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où AA est l’activité antioxydante d’un extrait donné (%), T la température à laquelle l’extraction a lieu (°C) et p la pression d’extraction (bar). L’analyse ANOVA a démontré que le modèle était significatif (F = 27,16, p < 0,0001). Le R² préd. a une valeur de 0,6726, ce qui est acceptable par rapport au R² aj. de 0,8674. L’activité antioxydante la plus élevée a été obtenue dans les conditions de température (60 °C) et de pression (30 MPa) les plus élevées (AA = 73,72 %). Une activité de piégeage du DDPH allant jusqu’à 71,52 % a été rapportée pour les extraits méthanoliques d’A. montana.
À partir de la teneur totale en composés phénoliques mesurée dans les extraits, une équation quadratique a été établie à l’aide du logiciel Design-Expert, avec des limites inférieures de 10 MPa et 40 °C et des limites supérieures de 30 MPa et 60 °C.
GA = 48,21307 − 0,876603 · T + 0,016375 · p + 0,004098 · T · p − 0,000511 · p²
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où GA représente la teneur totale en composés phénoliques de chaque extrait, T la température à laquelle l’extraction a lieu (°C) et p la pression d’extraction (bar). L’analyse ANOVA a démontré que le modèle était significatif (F = 23,30, p = 0,0002). Le R² préd. a une valeur de 0,6816, ce qui est acceptable par rapport au R² aj. de 0,8814. Comme le montre la figure 1C, la teneur en composés phénoliques la plus élevée a été obtenue à des pressions comprises entre 14 et 22 MPa. Du point de vue de l’économie du procédé, il ressort clairement du graphique qu’une température de 40 °C et une pression de 16 MPa suffiraient à obtenir des valeurs élevées de composés phénoliques totaux. La teneur totale en composés phénoliques des extraits diminuait à des pressions supérieures à 22 MPa, probablement parce que, dans ces conditions, la sélectivité du solvant pour les espèces phénoliques diminue. La polarité du mélange de solvants peut devenir plus faible, ce qui réduit la solubilité des composés phénoliques polaires.
Le pourcentage d’acides phénoliques totaux dans les extraits variait de 1,31 à 3,25 %. À titre de comparaison, des teneurs en acides phénoliques totaux de 1,03 à 2,24 % et de 1,32 à 2,35 % ont été rapportées. Dans les deux études, les extraits de capitules avaient été préparés par extraction ultrasonique au méthanol.
Pour la teneur en proanthocyanidines, une équation quadratique a été établie à l’aide du logiciel Design-Expert, avec des limites inférieures de 10 MPa et 40 °C et des limites supérieures de 30 MPa et 60 °C.
PAC = −6,31204 + 0,238379 · T + 0,052336 · p − 0,002550 · T² − 0,000125 · p²
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où PAC est la teneur en proanthocyanidines de chaque extrait (mg/g d’extrait), T est la température à laquelle l’extraction a lieu (°C) et p est la pression d’extraction (bar). Le R² préd. a une valeur de 0,8420, ce qui est acceptable par rapport au R² aj. de 0,9502. Leur différence est inférieure à 0,2. La figure 1D montre qu’une température ou une pression trop élevée exerce un effet négatif sur la teneur en proanthocyanidines des extraits. Les valeurs les plus élevées ont été obtenues à des pressions comprises entre 180 et 24 MPa et à des températures comprises entre 37 et 55 °C. À notre connaissance, aucune étude n’a encore rapporté la teneur en proanthocyanidines d’extraits d’A. montana.
Les conditions optimales pour les proanthocyanidines (figures 1Da,b) présentes dans l’extrait ont été déterminées selon la méthodologie des surfaces de réponse et les plages définies dans les équations du modèle (équation 5). Contrairement aux proanthocyanidines, les conditions optimales d’extraction (30 MPa et 60 °C) ont donné les valeurs les plus élevées pour le rendement d’extraction, l’activité antioxydante et les composants phénoliques. Par conséquent, ces variables dépendantes ne peuvent pas encore être considérées comme pleinement optimisées et de futures études devraient examiner leur teneur dans des conditions opératoires dépassant les limites de cette étude. Il est important de noter qu’au-delà de cette limite, les caractéristiques du solvant peuvent changer en raison de la variation des conditions du procédé et de la plus faible solubilité des composants recherchés.
3.2 Activité antimicrobienne des extraits
Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) des extraits d’A. montana sur la bactérie à Gram positif S. aureus, la bactérie à Gram négatif E. coli et la levure C. albicans sont présentées dans le tableau 2. Tous les extraits testés ont inhibé efficacement les micro-organismes, S. aureus étant le plus sensible et C. albicans le plus résistant à l’extrait. Les valeurs de CMI allaient de 0,10 à 0,31 mg/ml pour S. aureus, de 1,23 à 2,58 mg/ml pour E. coli et de 1,41 à 5,16 mg/ml pour C. albicans.
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Divers effets des extraits de fleurs d’A. montana sur les micro-organismes ont été rapportés dans la littérature. Une activité antimicrobienne contre les micro-organismes utilisés dans cette étude avait déjà été confirmée pour les extraits aqueux, éthanoliques et méthanoliques, mais la présente étude a été la première à confirmer une activité antimicrobienne pour un extrait SCF-CO₂. Une CMI de 16,7 mg/ml a été déterminée pour des extraits aqueux de fleurs contre S. aureus et E. coli, tandis qu’une CMI de 5 μl/ml a été rapportée pour des extraits méthanoliques contre ces deux bactéries ; C. albicans a montré une résistance plus élevée, avec des valeurs de CMI atteignant 83 μl/ml. Ces résultats concordent avec les études rapportant l’effet des extraits sur la croissance microbienne. Une inhibition plus importante de l’extrait d’A. montana contre S. aureus que contre E. coli a été constatée dans deux études, tandis que l’une d’elles a confirmé la résistance plus élevée de C. albicans.
Les extraits alcooliques de la plante inhibent divers autres genres non inclus dans cette étude, depuis les bactéries à Gram positif Actinomyces spp., Bacillus spp., Listeria sp., Micrococcus spp. et Peptostreptococcus sp. jusqu’aux bactéries à Gram négatif Acinetobacter sp., Capnocytophaga sp., Eikenella sp., Fusobacterium sp., Klebsiella sp., Listonella sp., Photobacterium sp., Porphyromonas sp., Prevotella sp., Pseudomonas sp., Salmonella sp. et Veillonella sp.
Une recherche approfondie dans la littérature pertinente a permis de trouver deux études connexes qui n’ont rapporté aucune activité antimicrobienne contre S. aureus et E. coli pour des extraits éthanoliques et des huiles essentielles préparées par distillation à la vapeur. Cependant, les extraits ont montré une inhibition contre Actinomyces naeslundii, Porphyromonas gingivalis et Streptococcus mutans.
Les CMI des extraits décrits dans cette étude, préparés par extraction supercritique au CO₂, sont similaires à celles précédemment décrites pour des extractions conventionnelles. La CMI des antibiotiques est de 0,25 à 4 μg/ml pour S. aureus et de 0,008 à 2 μg/ml pour E. coli. Des CMI contre S. aureus de 0,25 μg/ml pour la pénicilline et de 4 μg/ml pour la ciprofloxacine ont été rapportées. Des CMI contre E. coli comprises entre 0,008 et 0,03 μg/ml pour la pénicilline et entre 0,5 et 2 μg/ml pour la ciprofloxacine ont été rapportées. La CMI contre C. albicans est comprise entre 0,03 et 32 μg/ml pour quatre fongicides différents.
3.3 Activité anticancéreuse des extraits sur les cellules de mélanome et apoptose cellulaire
Les extraits d’A. montana ont montré une activité cytotoxique contre les cellules de mélanome WM-266-4. La figure 2 montre la morphologie cellulaire 24 h après l’exposition à l’extrait d’A. montana. Le groupe témoin non traité présentait une morphologie cellulaire typique avec un phénotype dendritique. Une diminution de la densité cellulaire a été observée à mesure que la concentration de l’extrait augmentait. À une concentration d’extrait de 0,5 mg/ml ou plus, la cytotoxicité était clairement visible, les cellules se condensant et se désintégrant en corps apoptotiques.
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La figure 3 montre l’activité métabolique des cellules de mélanome WM-266-4 en fonction de la concentration de l’extrait d’A. montana, 24 h après l’exposition. L’activité métabolique des cellules cancéreuses a été efficacement inhibée par les extraits à des concentrations allant de 5 à 0,5 mg/ml. L’activité métabolique des cellules cancéreuses a diminué jusqu’à environ 14 % de celle du témoin présentant une morphologie cellulaire typique. La concentration efficace médiane (CE₅₀) de l’extrait était légèrement inférieure à 0,05 mg/ml, puisque les cellules présentaient une MA de 48,2 % par rapport au témoin.
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La significativité ainsi que la variabilité des résultats ont été confirmées par une expérience sur des mélanocytes épidermiques humains normaux. Les résultats montrent que l’activité métabolique a diminué de 7 % après l’application de l’extrait, ce qui reste dans l’intervalle des écarts observés lorsque les résultats témoins sont répétés. Selon les résultats, l’application de l’extrait n’a pas d’effet significatif sur les cellules saines.
L’apoptose cellulaire a également été étudiée pour étayer les résultats relatifs à l’activité métabolique des cellules cancéreuses. La réponse des cellules à l’extrait a été étudiée plus en détail à trois concentrations (c₁ = 0,1 mg/ml, c₂ = 0,25 mg/ml, c₃ = 0,5 mg/ml). Après 24 h d’incubation des cellules avec l’extrait, les cellules ont été colorées avec le réactif Muse™ Annexin V & Dead Cell et enregistrées à l’aide de l’analyseur cellulaire Muse™. Le graphique de la figure 4 présente un résultat d’essai représentatif obtenu avec des cellules WM-266-4 non traitées et des cellules WM-266-4 traitées avec des extraits aux concentrations c₁, c₂ et c₃. On peut y observer le pourcentage de cellules vivantes [Annexine (−) 7-AAD (−)], de cellules en apoptose précoce [Annexine (+) 7-AAD (−)], de cellules en apoptose tardive [Annexine (+) 7-AAD (+)] et de résidus cellulaires [Annexine (−) 7-AAD (+)].
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Les résultats relatifs à l’apoptose montrent que les cellules non traitées atteignent des niveaux élevés dans la zone Annexine (−) 7-AAD (−), qui correspond aux cellules saines et vivantes. En revanche, après l’application de l’extrait à la concentration c₁, environ 50 % des cellules se trouvaient dans la zone Annexine (+) 7-AAD (+), qui correspond à l’apoptose tardive. Nous pouvons donc conclure que la concentration c₁ inhibait déjà le fonctionnement de la moitié des cellules. Toutefois, l’application de l’extrait à une concentration plus élevée (c₂ et c₃) a fortement supprimé les cellules. À c₂, le pourcentage le plus élevé de cellules se trouvait dans la zone Annexine (+) 7-AAD (+). Des résultats similaires sont observés pour c₃ ; toutefois, les débris [Annexine (−) 7-AAD (+)] étaient significativement plus abondants qu’aux autres concentrations.
4 Conclusion
Dans cette étude, les conditions optimales d’extraction supercritique d’A. montana ont été déterminées afin d’obtenir le rendement d’extraction et la teneur en composants biologiquement actifs les plus élevés. Des modèles quadratiques ont été ajustés avec succès pour le rendement d’extraction d’A. montana, l’activité antioxydante (AA) et la teneur totale en composés phénoliques (GA). Tandis que des conditions de température et de pression élevées entraînaient des rendements d’extraction et une activité antioxydante élevés, la teneur totale en composés phénoliques diminuait à des pressions supérieures à 22 MPa. De même, des conditions de pression et de température modérées étaient également préférables pour les proanthocyanidines.
Les extraits préparés présentant la teneur la plus élevée en principes biologiquement actifs ont efficacement inhibé tous les micro-organismes testés. Une inhibition significative de la bactérie à Gram positif S. aureus a été détectée à une CMI comprise entre 0,10 mg/ml et 0,31 mg/ml. L’extrait supercritique obtenu à 40 °C et 30 MPa a inhibé les bactéries à une CMI de 0,10 mg/ml. Pour la bactérie à Gram négatif E. coli, les valeurs de CMI allaient de 1,23 à 2,58 mg/ml. Toutefois, la CMI la plus faible a été requise par le même extrait que pour S. aureus (40 °C, 30 MPa). Le champignon C. albicans (CMI = 1,41 mg/ml–5,16 mg/ml) a également été inhibé par tous les extraits. L’extrait préparé à 50 °C et 20 MPa nécessitait la concentration la plus faible (1,41 mg/ml). La CMI des extraits préparés est comparable à celle des antibiotiques utilisés contre S. aureus et E. coli et à celle des fongicides utilisés contre C. albicans. Cela confirme le potentiel de l’extrait pour une utilisation comme équivalent des antibiotiques topiques.
Cette étude a également confirmé que les extraits préparés exerçaient un effet anticancéreux par l’inhibition de l’activité métabolique des cellules de mélanome. Cela indique la nécessité de poursuivre les recherches sur la structure moléculaire de l’extrait et sur la mise en œuvre de ses composants, individuellement et en association, en vue du développement de traitements antibiotiques et du mélanome.