Huile essentielle des akènes d’Arnica montana L. : caractéristiques chimiques et activité anticancéreuse
Référence : Molecules 2019. — PMC6891426 · DOI 10.3390/molecules24224158 Type : étude phytochimique et étude in vitro · Plante : Arnica des montagnes · Propriété → Cancer Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
L’arnica des montagnes, Arnica montana L., est une source de plusieurs classes de métabolites présentant diverses activités biologiques. La composition chimique de l’huile essentielle et de ses principaux composants volatils chez l’arnica peut varier en fonction de la région géographique, des facteurs environnementaux et de l’organe végétal. L’objectif de cette étude était de caractériser la composition chimique de l’huile essentielle issue des akènes d’A. montana et d’étudier son effet sur l’induction de l’apoptose et de l’autophagie dans les lignées cellulaires humaines MOGGCCM d’astrocytome anaplasique et T98G de glioblastome multiforme. La composition chimique de l’huile essentielle extraite des akènes a été examinée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS). Seulement 16 composants de l’huile essentielle obtenue à partir des akènes de plantes âgées de 3 ans et 18 composants de l’huile essentielle obtenue à partir des akènes de plantes âgées de 4 ans constituaient respectivement environ 94,14 % et 96,38 % de la teneur totale en HE. Les principaux composants de l’HE des akènes d’arnica étaient le 2,5-diméthoxy-p-cymène (39,54 et 44,65 %), le cumène (13,24 et 10,71 %), l’éther méthylique de thymol (8,66 et 8,63 %), le 2,6-diisopropylanisole (8,55 et 8,41 %), le décanal (7,31 et 6,28 %) et le 1,2,2,3-tétraméthylcyclopent-3-énol (4,33 et 2,94 %), respectivement chez les plantes âgées de 3 et 4 ans. Il a été constaté que les huiles essentielles exerçaient un effet anticancéreux en induisant la mort des cellules d’astrocytome anaplasique et de glioblastome multiforme. L’induction de l’apoptose à un niveau de 25,7–32,7 % permet d’envisager l’utilisation de ce métabolite secondaire dans de futures études axées sur le développement d’un traitement des gliomes. Ce composant joue probablement un rôle essentiel dans l’activité anticancéreuse contre les lignées cellulaires MOGGCCM et T98G. La présente étude constitue le premier rapport sur la composition et les activités anticancéreuses de l’huile essentielle des akènes d’A. montana, et des études supplémentaires sont nécessaires pour explorer son potentiel en vue de futures applications médicinales.
1. Introduction
Arnica montana L. est une source de plusieurs composés actifs (lactones sesquiterpéniques, flavonoïdes, terpénoïdes, acides phénoliques et huiles essentielles) présentant des activités antibactériennes, antifongiques, antiseptiques, anti-inflammatoires, antiradicalaires, antisclérotiques et antioxydantes. La composition chimique de l’huile essentielle (HE) et de ses principaux composants volatils chez l’arnica peut varier en fonction de la région géographique et des facteurs environnementaux. Les huiles essentielles extraites de différents organes de nombreux spécimens provenant de diverses régions d’Europe sont principalement composées d’hydrocarbures sesquiterpéniques (par ex., E-caryophyllène, germacrène D, α-humulène, bicyclogermacrène), de monoterpénoïdes oxygénés (par ex., 1,8-cinéole, linalol), de sesquiterpénoïdes oxygénés (par ex., oxyde de caryophyllène, α-cadinol) et de composés dérivés phényliques (par ex., 2,5-diméthoxy-p-cymène, éther méthylique de thymol, p-méthoxyheptanophénone et 2,6-diisopropylanisole). Comme indiqué dans la littérature, l’HE extraite d’organes de l’arnica tels que les capitules, les rhizomes, les racines de la plante et les racines chevelues peut varier. Ce fait laisse entrevoir de très vastes possibilités d’utilisation de ces métabolites secondaires chimiquement différents. Le rendement en graines et les caractéristiques de germination ont été étudiés lors de l’introduction d’une population sauvage d’arnica dans des conditions de culture en plein champ. La dispersion des graines a été analysée sous l’angle de la protection des plantes ainsi que de la restauration et du développement des communautés végétales menacées. Notre étude antérieure portait sur les profils phénoliques et les capacités antioxydantes d’extraits d’akènes en tant que nouvelles sources d’antioxydants naturels, dans la perspective de poursuivre les recherches sur les composés chimiques contenus dans les akènes d’arnica des montagnes. Cette étude a été menée afin de déterminer une nouvelle qualité de métabolites secondaires chez, par exemple, A. montana, une espèce végétale pharmacopéique très intéressante et précieuse. Les akènes constituent une source alternative de substances biologiques, outre les capitules, les rhizomes, les racines et la plante herbacée.
Le cancer est un problème mondial croissant. Dans un rapport sur la charge mondiale du cancer, il a été estimé qu’il y aurait 18,1 millions de nouveaux cas et 9,6 millions de décès dus au cancer dans le monde en 2018. Pour le cerveau et le système nerveux, il y avait 296 851 nouveaux cas et plus de 81 % de décès. Par conséquent, de nombreux traitements et thérapies alternatifs à base de plantes ont été explorés, ce qui est particulièrement important pour les patients qui ne tolèrent pas les effets secondaires extrêmes. Bien que la recherche sur l’utilisation des HE comme agents thérapeutiques anticancéreux soit relativement récente, environ la moitié des agents chimiothérapeutiques conventionnels sont d’origine végétale, approximativement 25 % étant directement issus de plantes et 25 % étant des versions chimiquement modifiées de phytoproduits. Les plantes ont été analysées afin d’identifier leurs propriétés anticancéreuses et caractérisées chimiquement pour révéler la présence de nombreux composés bioactifs, par ex., des polyphénols, des taxols, des brassinostéroïdes, etc. Le principal groupe de gliomes malins est représenté par l’astrocytome anaplasique (AA, grade III de l’OMS) et le glioblastome multiforme (GBM, grade IV de l’OMS). Malgré les efforts considérables consacrés à l’amélioration des mesures thérapeutiques telles que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, l’issue clinique des gliomes reste consternante. Il a été rapporté que divers types de tumeurs malignes, tels que les gliomes, régressent après un traitement par des huiles essentielles végétales. On suppose donc que de telles molécules possèdent des activités anticancéreuses potentielles utiles dans les stratégies de prévention et de traitement. Il est par conséquent urgent de rechercher de nouvelles substances, par ex., des huiles essentielles, afin d’élucider les bases moléculaires de la progression maligne des gliomes.
Les produits naturels et leurs dérivés sont d’importantes sources de nouvelles molécules thérapeutiques. Les HE sont utilisées depuis l’Antiquité dans les systèmes de médecine traditionnelle au cours de l’histoire humaine. Des chercheurs du monde entier tentent de caractériser l’éventail des propriétés biologiques des HE, qui comprend des activités antimicrobiennes, antivirales, antimutagènes, anticancéreuses, antioxydantes, anti-inflammatoires, immunomodulatrices et antiprotozoaires. L’intérêt pour les plantes médicinales ne cesse de croître du fait de l’augmentation de la demande humaine ; ainsi, de nouvelles combinaisons de composants d’HE peuvent présenter de nouvelles propriétés et activités susceptibles d’être utilisées à l’avenir en médecine, en pharmacie ou dans l’industrie cosmétique. Dans le cas d’A. montana, les connaissances sur les caractéristiques chimiques et l’activité biologique des akènes sont insuffisantes. Les résultats présentés dans cet article comblent donc partiellement cette lacune et fournissent des informations pouvant constituer la première étape d’études sur l’activité anticancéreuse des métabolites secondaires de l’arnica des montagnes. L’objectif de cette étude était donc (i) de caractériser la composition chimique de l’HE issue d’akènes d’A. montana récoltés sur des plantes âgées de 3 et 4 ans, et (ii) d’étudier l’effet de l’HE analysée sur l’induction de l’apoptose et de l’autophagie dans les lignées cellulaires humaines MOGGCCM d’astrocytome anaplasique et T98G de glioblastome multiforme.
2. Résultats
2.1. Caractéristiques chimiques de l’HE
Le rendement en huile essentielle et la teneur en composants de l’HE obtenue à partir des akènes de plantes d’arnica des montagnes âgées de 3 ans (HE-3) et de l’HE obtenue à partir des akènes de plantes âgées de 4 ans (HE-4) sont présentés dans le tableau 1. La teneur en HE était respectivement de 0,167 % et 0,145 % v/w dans l’HE-3 et l’HE-4. Il existe de légères différences de composition chimique entre les deux échantillons. Seulement 16 composants de l’HE issue des akènes récoltés sur les spécimens âgés de 3 ans et 18 composants de l’HE issue des akènes des plantes âgées de 4 ans constituaient respectivement environ 94,14 % et 96,38 % de la teneur totale en HE. L’HE étudiée était dominée par des constituants dérivés phényliques, qui représentaient respectivement 48,09 et 53,06 % dans l’HE-3 et l’HE-4 (tableau 1). Les monoterpènes (23,77 et 20,49 %) constituaient la deuxième grande classe de composés. L’autre classe de composés était représentée par les sesquiterpènes (10,06 et 10,05 %) et les aldéhydes aliphatiques (respectivement 7,31 et 6,28 % dans l’HE-3 et l’HE-4). Les principaux composants de l’HE des akènes d’arnica étaient le 2,5-diméthoxy-p-cymène (39,54 et 44,65 %), le cumène (13,24 et 10,71 %), l’éther méthylique de thymol (8,66 et 8,63 %), le 2,6-diisopropylanisole (8,55 et 8,41 %), le décanal (7,31 et 6,28 %) et le 1,2,2,3-tétraméthylcyclopent-3-énol (4,33 et 2,94 %), respectivement chez les plantes âgées de 3 et 4 ans. La concentration de composants de l’HE tels que le cumène, le 1,2,2,3-tétraméthylcyclopent-3-énol, l’oxyde d’α-pinène, le β-maaliène, l’E-α-bergamotène et la lippifoli-1(6)-én-5-one était plus élevée dans l’HE-3. À l’inverse, des concentrations plus élevées de 7-épi-silphiperfol-5-ène, d’α-isocomène, de 2,5-diméthoxy-p-cymène, d’E-caryophyllène et d’oxyde de caryophyllène ont été déterminées dans l’HE-4.
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2.2. Activité anticancéreuse
Pour estimer la sensibilité des cellules MOGGCCM et T98G au traitement par l’HE des akènes d’arnica, une méthode de coloration faisant appel à des colorants spécifiques de l’apoptose, de la nécrose et de l’autophagie, à savoir respectivement le Hoechst 33342, l’iodure de propidium et l’orange d’acridine, a été utilisée (figures 1, 2, 3 et 4). Les résultats de l’ANOVA à deux facteurs ont montré un effet principal significatif de la concentration d’HE uniquement sur l’apoptose, la nécrose et l’autophagie des cellules MOGGCCM (respectivement F = 160,70, p < 0,001 ; F = 877,9, p < 0,001 ; F = 16,18, p < 0,001) et des cellules T98G (respectivement F = 416,11, p < 0,001 ; F = 5,79, p < 0,01 ; F = 5,42, p < 0,01). En revanche, aucun effet statistiquement significatif de l’âge de la plante (respectivement F = 0,75, p = 0,400 ; F = 0,51, p = 0,486 ; F = 0,14, p = 0,711) ni de l’interaction entre la concentration d’HE et l’âge de la plante n’a été confirmé (respectivement F = 1,7, p = 0,193 ; F = 0,68, p = 0,382 ; F = 0,17, p = 0,933).
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Les observations microscopiques ont révélé que l’HE-3 ajoutée au milieu de culture MOGGCCM à une concentration de 0,5 μL/mL exerçait un effet considérable sur l’induction de la mort cellulaire (figure 1). Une augmentation significative de 7,0 % du nombre de cellules apoptotiques sous l’influence de l’HE-3 a été observée à une concentration de 0,5 μL/mL (figure 1). Une nouvelle augmentation de la concentration d’HE a entraîné une hausse du niveau d’apoptose jusqu’à 25,7 %. Outre l’apoptose, l’HE-3 n’a initié la nécrose qu’à un niveau d’environ 1,3 %. La concentration d’HE de 2 μL/mL a provoqué une diminution du pourcentage de cellules apoptotiques, mais celle-ci n’était pas statistiquement significative. Cependant, malgré l’apoptose survenant à cette concentration d’HE, une nécrose (41,7 %) et une autophagie (1,0 %) ont été initiées.
L’application de 0,5 μL/mL d’HE-4 au milieu de culture MOGGCCM a eu un effet considérable sur la mort cellulaire, c’est-à-dire qu’une augmentation significative de 4,0 % du nombre de cellules apoptotiques a été observée à cette concentration (figure 2). Une nouvelle augmentation de la concentration d’HE a également entraîné une augmentation significative du niveau d’apoptose, qui a dépassé 29,0 %. La concentration d’HE-4 de 2 μL/mL a provoqué une diminution statistiquement significative du pourcentage de cellules apoptotiques (23,7 %). Cependant, malgré l’apoptose survenant à cette concentration d’HE, la nécrose a été initiée à un niveau de 31,7 %, supérieur au niveau d’apoptose. Il convient de souligner que ni l’HE-3 ni l’HE-4 n’ont initié d’autophagie dans le milieu de culture MOGGCCM (figures 1 et 2).
Les observations microscopiques ont montré que l’HE-3 appliquée à la concentration de 0,5 μL/mL dans le milieu de culture T98G avait un effet considérable sur la mort cellulaire (figure 3). Une augmentation significative de 19,3 % du nombre de cellules apoptotiques sous l’influence de l’HE a été observée à la concentration de 0,5 μL/mL (figure 3). Une nouvelle augmentation de la concentration d’HE-3 a également entraîné une augmentation d’environ 32,7 % du niveau d’apoptose. Outre l’apoptose, l’HE a initié la nécrose, mais seulement à un niveau d’environ 0,3 %. La concentration d’HE de 2 μL/mL a provoqué une diminution statistiquement significative du pourcentage de cellules apoptotiques jusqu’au niveau de 28,1 %. Cependant, malgré l’apoptose survenant à cette concentration d’HE, une nécrose à un niveau dépassant le pourcentage de cellules apoptotiques (23,7 %) a été initiée.
L’application d’HE-4 au milieu de culture T98G (figure 4) a provoqué une réaction similaire à celle décrite ci-dessus (figure 3). Une augmentation significative de 14,3 % du nombre de cellules apoptotiques a été induite par l’HE-4 appliquée à la concentration de 0,5 μL/mL. Une nouvelle augmentation de la concentration d’HE à 1 μL/mL a également entraîné une augmentation d’environ 27,7 % du niveau d’apoptose. À l’inverse, la concentration de 2 μL/mL a provoqué une augmentation progressive du pourcentage de cellules apoptotiques jusqu’à 33,0 % ; toutefois, celle-ci n’était pas statistiquement significative. Outre l’apoptose, l’HE a initié la nécrose à un niveau de 16,7 %. Il convient de souligner que ni l’HE-3 ni l’HE-4 n’ont provoqué d’autophagie dans le milieu de culture T98G. De façon analogue à la lignée MOGGCCM (figures 1 et 2), l’effet de l’HE-3 et de l’HE-4 sur l’induction de l’autophagie dans la lignée T98G n’était pas significatif (figures 3 et 4).
L’analyse de l’IC50 a également révélé que les cellules MOGGCCM étaient plus sensibles à l’initiation de la mort cellulaire après traitement par les huiles essentielles que la lignée cellulaire T98G (tableau 2). Les huiles essentielles analysées n’ont eu aucun effet sur l’initiation de la mort cellulaire dans les fibroblastes normaux (données non présentées).
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3. Discussion
Seize composants de l’HE-3 des plantes d’arnica des montagnes et 18 composants de l’HE-4 constituaient respectivement environ 94,14 % et 96,38 % de la teneur totale en huile. Le nombre et la diversité des composants de l’HE des akènes d’A. montana étaient inférieurs à ceux de l’HE des capitules analysée dans une population de Lituanie. Dans la présente étude, le nombre de constituants était inférieur de 34 à celui de l’HE des capitules de Bosnie, inférieur de 42 à celui de l’HE des capitules de Serbie et inférieur de 24 à celui de l’HE des capitules de Pologne mise en évidence dans notre étude antérieure.
Les principaux composants de l’HE des akènes d’arnica étaient le 2,5-diméthoxy-p-cymène (39,54 et 44,65 %), le cumène (13,24 et 10,71 %), l’éther méthylique de thymol (8,66 et 8,63 %), le 2,6-diisopropylanisole (8,55 et 8,41 %), le décanal (7,31 et 6,28 %) et le 1,2,2,3-tétraméthylcyclopent-3-énol (4,33 et 2,94 %), respectivement dans l’HE-3 et l’HE-4. Cette composition de l’HE est très proche de la composition chimique des HE des rhizomes et des racines d’arnica rapportée par Pljevjakušić et al. Les auteurs ont montré que le 2,5-diméthoxy-p-cymène était le principal composant de l’HE des rhizomes (28,9–30,0 %) et des racines (37,9–40,6 %). L’autre molécule la plus abondante dans les rhizomes et les racines était l’éther méthylique de thymol, avec une concentration respective de 26,1 % et 27,2 %. À l’inverse, Weremczuk-Jeżyna et al. ont identifié deux composants principaux dans l’HE de racines chevelues cultivées in vitro et de racines d’Arnica montana, à savoir l’isobutyrate de 10-isobutyryloxy-8,9-didéhydro-thymol et l’éther méthylique de 10-isobutyryloxy-8,9-didéhydro-thymol. Fait intéressant, le 2,5-diméthoxy-p-cymène, c’est-à-dire le composé dominant dans l’HE des akènes d’arnica, n’a pas été détecté dans l’HE des capitules d’arnica des montagnes analysée dans nos études antérieures. Toutefois, les principaux composants de l’HE des capitules étaient l’E-caryophyllène, le germacrène D, le cumène, le p-cymène, le décanal et l’oxyde de caryophyllène. Le profil de l’HE des akènes d’arnica est semblable à celui de l’HE des rhizomes d’arnica, mais complètement différent du profil de l’HE des capitules d’arnica. Dans la présente étude, les dérivés phényliques constituaient le groupe le plus abondant (48,09 % et 53,06 %), suivis des monoterpènes (23,77 % et 20,49 %) et des sesquiterpènes (10,06 % et 10,05 %). Cependant, l’HE obtenue à partir des capitules d’arnica était caractérisée par une prédominance de sesquiterpènes (plus de 60 %).
La littérature contient des rapports récents sur les propriétés anticancéreuses de plusieurs huiles essentielles. Ces constituants actifs des HE semblent agir en synergie avec la chimiothérapie et la radiothérapie conventionnelles, et certaines études cliniques chez l’être humain ont été initiées. Une activité anticancéreuse a été détectée dans l’HE de diverses espèces végétales, par ex., Achillea fragrantissima, Lycopus lucidus, Porcelia macrocarpa et des espèces néotropicales du genre Piper. Comme le montre notre étude, des activités anticancéreuses ont également été constatées dans l’HE des akènes d’A. montana (figures 1, 2, 3 et 4). Cette espèce végétale peut donc être incluse dans le groupe présentant un fort potentiel anticancéreux.
La composition chimique des HE est déterminée par un large éventail de facteurs. Ceux-ci comprennent les conditions environnementales, les variations saisonnières, les conditions météorologiques et climatiques ainsi que les phases de développement et l’âge de la plante. Il a par ailleurs été rapporté que l’effet d’une HE possédant une composition chimique donnée varie en fonction du type de cancer. Yu et al. ont indiqué que la cytotoxicité de l’HE de L. lucidus contre des lignées cellulaires de carcinome hépatique et de cancer du sein était significativement plus forte que contre d’autres lignées cellulaires. De même, da Silva et al. ont montré une activité cytotoxique variable des huiles de Piper aleyreanum sur des lignées cellulaires de cancer du côlon et de mélanome. Lima et al. ont mis en évidence différents niveaux d’activité cytotoxique des huiles de P. klotzschianum, qui inhibaient des lignées cellulaires de carcinome hépatocellulaire humain, de leucémie promyélocytaire humaine et de mélanome murin. À l’inverse, un large spectre de cytotoxicité a été démontré pour l’huile de P. cernuum contre, notamment, des cellules de mélanome murin, de mélanome humain, de tumeur cervicale humaine, de leucémie myéloïde humaine et de glioblastome humain. Dans la présente étude, la qualité de l’HE-3 et de l’HE-4 était similaire. Le 2,5-diméthoxy-p-cymène était le composant dominant de l’HE ; en outre, l’impact de l’HE sur les lignées cellulaires MOGGCCM et T98G (apoptose, nécrose et autophagie) était similaire. Cela implique que l’âge des plantes d’arnica n’affecte ni la composition chimique étudiée ni l’activité antitumorale de leur huile essentielle.
L’apoptose ou l’autophagie sont des mécanismes responsables de l’induction de la mort cellulaire programmée dans les gliomes malins. La concentration d’HE joue un rôle essentiel dans le traitement des lignées cellulaires cancéreuses humaines par l’inhibition de la croissance cellulaire et a un impact sur ces mécanismes. Dans le cas des lignées MOGGCCM et T98G étudiées, la concentration de 0,5 μL/mL a initié l’apoptose sans induire de nécrose ni d’autophagie. La concentration de 1 μL/mL a provoqué l’apoptose sans induire d’autophagie. Les activités biologiques de l’HE des akènes d’A. montana en font donc une source de molécules susceptibles d’être exploitées en médecine et dans l’industrie pharmaceutique. Les résultats sont très prometteurs dans la perspective d’études ultérieures axées sur l’isolement des principaux composants, leur application dans des études sur les lignées MOGGCCM et T98G, ainsi que l’analyse de la mort cellulaire programmée typique et de son mécanisme moléculaire.
Les gliomes sont des tumeurs cérébrales agressives présentant une très forte résistance à la chimiothérapie. Les composés bioactifs naturels peuvent agir en synergie avec des médicaments dans des applications pharmacologiques. C’est pourquoi, dans les études sur l’efficacité de différentes substances pour éliminer les cellules de gliome humain par apoptose et autophagie, une tentative a été faite pour utiliser la quercétine dans de telles associations. La quercétine est un flavonoïde présent dans les capitules d’A. montana et d’A. chamissonis et caractérisé par différentes applications biologiques, pharmacologiques et médicales. L’étude de l’efficacité de telles associations dans l’induction de la mort cellulaire programmée dans les gliomes humains a montré que la quercétine exerce un effet toxique sur la lignée cellulaire MOGGCCM d’astrocytome, en induisant la nécrose plutôt que la mort cellulaire programmée. Toutefois, l’HE des akènes d’arnica des montagnes a induit l’apoptose de la lignée cellulaire MOGGCCM sans induire de nécrose ni d’autophagie. L’augmentation de la concentration d’HE à 1 μL/mL a entraîné une augmentation du niveau d’apoptose jusqu’à 25,7 % et 29,0 %, et jusqu’à 27,7 % et 32,7 % respectivement dans les lignées cellulaires MOGGCCM et T98G (figures 1, 2, 3 et 4), ce qui suggère qu’il s’agit d’un produit anticancéreux naturel plus prometteur que la quercétine.
Il n’existe que peu d’études sur les effets des HE ou de leurs composants sur les cellules de gliome. Parmi ceux qui produisent les effets les plus spectaculaires figure l’α-bisabolol, c’est-à-dire un composé naturel non toxique qui induit fortement l’apoptose dans les cellules de gliome. Il a été montré que le thymol exerce un effet inhibiteur sur l’apoptose et la croissance cellulaire dans le glioblastome humain DBTRG-05MG. Le β-élémène, médicament végétal naturel extrait de Curcuma wenyujin, a montré des effets anticancéreux prometteurs contre un large spectre de tumeurs, en induisant également l’apoptose des cellules de glioblastome. Cependant, la littérature ne contient aucun rapport sur l’effet d’extraits ou d’HE d’arnica des montagnes sur l’induction de l’apoptose des cellules de glioblastome, en particulier dans les lignées cellulaires MOGGCCM et T98G. La présente étude a montré que l’HE a un impact sur la mort des cellules de gliome. Il s’agit d’une observation importante, notamment à la lumière de recherches récentes montrant que les gliomes résistent naturellement à l’apoptose. Les HE d’arnica analysées sont caractérisées par une prédominance de 2,5-diméthoxy-p-cymène comprise entre 39,54 et 44,65 % ; elles constituent donc une source riche de cette molécule extrêmement intéressante. Les huiles essentielles dont ce composé est un composant majeur ont des propriétés antibactériennes, antifongiques et insecticides. Le 2,5-diméthoxy-p-cymène est un composant dominant de l’HE d’Eupatorium triplinerve, de Bubonium imbricatum, d’Ayapana triplinervis, de Pulicaria mauritanica, de Limbarda crithmoides et de Laggera crispata. Il joue donc probablement un rôle essentiel dans l’activité anticancéreuse de l’HE vis-à-vis des lignées cellulaires MOGGCCM et T98G. L’induction de l’apoptose à un niveau de 25,7–32,7 % présentée dans cet article a démontré l’activité anticancéreuse de l’HE. Les informations obtenues dans cette étude indiquent la nécessité de poursuivre les recherches sur l’effet anticancéreux des HE d’arnica et du 2,5-diméthoxy-p-cymène contre les gliomes, ainsi que sur l’élucidation des mécanismes moléculaires anticancéreux de cette molécule.
4. Matériel et méthodes
4.1. Matériel végétal
Les akènes d’arnica ont été récoltés lorsqu’ils étaient complètement mûrs. Les akènes provenaient de plantes âgées de 3 et 4 ans cultivées dans les champs expérimentaux de l’Université des sciences de la vie de Lublin, situés dans l’est de la Pologne (51°31′25″ N ; 22°45′04″ E), sur un sol podzolique gris-brun à composition granulométrique de sable limoneux lourd.
4.2. Analyse qualitative et quantitative de l’huile essentielle
4.2.1. Dosage de la teneur en huile essentielle
Les akènes d’A. montana ont été séchés à l’air et n’ont pas été broyés. Les huiles essentielles ont été obtenues par hydrodistillation à l’aide d’un appareil de type Deryng, conformément à la procédure de la Pharmacopée polonaise VI. La durée de la distillation était de 3 h. À cette fin, 20,0 g d’akènes et 400 mL d’eau ont été utilisés. La durée de la distillation était de 3 h. L’analyse a été réalisée en cinq répétitions.
4.2.2. Analyse par GC-MS
L’analyse chromatographique a été réalisée selon des procédures décrites précédemment. L’analyse a été effectuée en trois exemplaires. Les huiles essentielles ont été analysées à l’aide d’un système Varian 4000 GC–MS/MS (Varian, Palo Alto, Californie, États-Unis). Les composés ont été séparés sur une colonne VF–5 ms de 30 m × 0,25 mm × 0,25 μm (Varian, Palo Alto, Californie, États-Unis). La température de la colonne a été augmentée de 50 °C à 250 °C à une vitesse de 4 °C/min ; température de l’injecteur : 250 °C ; rapport de division : 1:50 ; volume d’injection : 5 μL. Les paramètres de SM étaient les suivants : mode EI, avec une tension d’ionisation de 70 eV ; température de la source d’ions : 200 °C ; plage de balayage : 40–870 Da.
4.2.3. Analyse qualitative et quantitative
L’analyse qualitative a été réalisée à partir des spectres de masse, qui ont été comparés aux spectres de la bibliothèque NIST et aux données disponibles dans la littérature. L’identité des composés a été confirmée à l’aide de leurs indices de rétention provenant de la littérature et de nos données relatives aux étalons décrites précédemment. L’analyse quantitative a été réalisée par la méthode d’ajout d’un étalon interne (alcanes C12 et C19), conformément aux procédures décrites précédemment.
4.3. Cellules de gliome et culture
4.3.1. Cellules et conditions de culture
Des cellules humaines de glioblastome multiforme (T98G, European Collection of Cell Cultures) et des cellules humaines d’astrocytome anaplasique (MOGGCCM, European Collection of Cell Cultures) ont été cultivées dans un mélange 3:1 de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et de mélange nutritif F-12 de Ham (Sigma, Saint-Louis, Missouri, États-Unis), additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (Sigma), de pénicilline (100 unités/mL) (Sigma) et de streptomycine (100 μg/mL) (Sigma, Saint-Louis, Missouri, États-Unis). Les cultures ont été maintenues à 37 °C dans une atmosphère humidifiée composée de 95 % d’air et de 5 % de CO2. Des cultures primaires de fibroblastes cutanés humains ont été préparées selon une méthode décrite précédemment.
4.3.2. Détection de l’apoptose, de la nécrose et de l’autophagie
L’apoptose, l’autophagie et la nécrose ont été identifiées au microscope après coloration, respectivement, avec les fluorochromes Hoechst 33342 (Sigma), orange d’acridine (Sigma, Saint-Louis, Missouri, États-Unis) et iodure de propidium (Sigma, Saint-Louis, Missouri, États-Unis), comme décrit précédemment. Un microscope à fluorescence (Nikon E-800, Tokyo, Japon) a été utilisé pour l’analyse morphologique des cellules mortes. Au moins 1 000 cellules situées dans des champs microscopiques sélectionnés aléatoirement ont été comptées au microscope. Chaque expérience a été répétée trois fois, avec 1 000 cellules à chaque fois. En outre, les concentrations inhibitrices à 50 % (valeurs d’IC50) ont été déterminées pour tous les extraits testés à l’aide de GraphPad Prism version 7 (GraphPad Software, San Diego, Californie, États-Unis).
4.4. Analyse statistique
La normalité (test de Shapiro-Wilk) et l’hétérogénéité de la variance (test de Levene) ont été testées, et des données transformées ont été utilisées lorsque cela était nécessaire. L’analyse de variance à deux facteurs (ANOVA), suivie de tests de Tukey, a été utilisée. Les résultats ont été exprimés sous forme de moyennes ± ET, et les différences ont été considérées comme significatives à p < 0,05. Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel Statistica 6.0 (Stat. Soft, Inc., Cracovie, Pologne).
5. Conclusions
L’huile essentielle des akènes d’A. monatana est décrite pour la première fois dans cet article. Sa qualité et sa composition chimique diffèrent de celles des huiles essentielles des capitules et des racines de populations d’arnica de différentes régions d’Europe. Les HE exercent un effet anticancéreux en induisant la mort des cellules d’astrocytome anaplasique et de glioblastome multiforme. L’activité exprimée par l’induction de l’apoptose à un niveau de 25,7–32,7 % permet d’envisager l’utilisation de ce métabolite secondaire dans des études ultérieures axées sur le développement futur d’un traitement des gliomes. L’huile essentielle des akènes d’A. monatana est caractérisée par une prédominance de 2,5-diméthoxy-p-cymène. Ce composant joue probablement un rôle essentiel dans l’activité anticancéreuse contre les lignées cellulaires MOGGCCM et T98G. Les connaissances et les informations obtenues dans cette étude indiquent la nécessité de poursuivre les recherches sur l’effet anticancéreux du 2,5-diméthoxy-p-cymène sur les lignées cellulaires MOGGCCM et T98G et d’élucider les mécanismes moléculaires anticancéreux de ce composé.