Effet des différentes parties de la plante Arnica montana L. sur la composition de l’huile essentielle, l’activité antimicrobienne et les interactions synergiques avec les antibiotiques
Référence : Molecules 2025. — PMC12472213 · DOI 10.3390/molecules30183812 Type : étude in vitro · Plante : Arnica des montagnes · Propriété → Antimicrobien Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Arnica montana L. (arnica des montagnes) est une plante médicinale aux activités biologiques diverses, couramment utilisée en pharmacie et en cosmétique. Les propriétés d’A. montana sont notamment liées à la concentration et à la composition chimique de ses huiles essentielles (HE). Par conséquent, les objectifs de cette étude étaient : (i) de caractériser la composition chimique des HE obtenues à partir des capitules, des rhizomes et des racines d’arnica des montagnes utilisés comme matière première pharmacopéique, (ii) de mettre en évidence les effets de chaque type d’HE et de leurs associations sur l’activité antibactérienne, et (iii) de mettre en évidence l’effet de la présence des HE d’A. montana et de leurs associations avec des antibiotiques commerciaux sur leur activité antibactérienne. La composition chimique et les propriétés antibactériennes des huiles essentielles obtenues par hydrodistillation à partir de différentes parties d’A. montana ont été étudiées. La composition chimique des HE a été déterminée par la technique de GC–MS. L’E-caryophyllène, l’oxyde de caryophyllène, le germacrène D, l’acétate de farnésyle et le dodécanal étaient les principaux composants de l’HE distillée à partir des capitules. En revanche, le 2,5-diméthoxy-p-cymène, le 2,6-diisopropylanisole, la p-méthoxyheptanophénone et l’éther méthylique de thymol étaient les principales molécules détectées dans l’HE provenant des rhizomes et des racines d’A. montana. Les données indiquent clairement que la présence d’HE d’arnica des montagnes, seule et en interaction avec des antibiotiques commerciaux (amoxicilline, ciprofloxacine, métronidazole), exerce un effet bénéfique sur leur activité antibactérienne.
1 Introduction
Arnica montana L. (arnica des montagnes) est endémique d’Europe et est protégée dans la plupart des pays européens. Les teintures ou pommades contenant des extraits de cette plante sont utilisées depuis plusieurs siècles dans le traitement de diverses affections, notamment les contusions, les plaies et les rhumatismes. A. montana est une source de lactones sesquiterpéniques, de flavonoïdes, de terpénoïdes, d’acides phénoliques et d’huiles essentielles (HE). Ces métabolites secondaires se caractérisent par des effets antioxydants, anti-inflammatoires, antiseptiques, antiradicalaires, antisclérotiques et anticancéreux, ainsi que par un large éventail d’activités biologiques diverses. Si les activités antioxydantes et antibactériennes des capitules d’arnica (Arnicae anthodium) ont fait l’objet d’études approfondies, les parties souterraines (Arnicae rhizome et Arnicae radix) ont été étudiées de manière moins exhaustive. Des études antérieures ont déterminé la composition chimique de l’HE issue des rhizomes et des racines, dont le 2,5-diméthoxy-p-cymène était le principal composant ; en outre, un rendement en HE très élevé a été rapporté : 4,05 % à partir des rhizomes et 1,89 % à partir des racines de plantes âgées de deux ans. D’autres études ont également mis en évidence la composition chimique de l’HE issue des rhizomes et des racines, l’absence de toxicité de l’HE aux concentrations utilisées dans l’expérience et ses propriétés anticancéreuses. La partie de la plante (rhizome, racine) et l’âge de la plante ont été désignés comme des déterminants de la composition de l’HE et, par conséquent, de son activité biologique. Toutefois, les propriétés antibactériennes de l’HE d’arnica n’ont pas été étudiées à ce jour, et les connaissances sur les propriétés biologiques des composés contenus dans les parties souterraines de la plante restent insuffisantes.
Des études antérieures ont déterminé la composition de l’HE provenant de différentes parties de plantes d’arnica (principalement les capitules) poussant dans des conditions pédologiques et climatiques différentes, dans divers pays européens, à différentes périodes et sous l’influence de différents facteurs expérimentaux. L’analyse simultanée de la composition chimique et des activités biologiques des HE obtenues à partir de différentes parties des mêmes plantes permet d’éliminer l’influence de la variation génétique et de facteurs tels que les conditions pédologiques, les conditions météorologiques et les conditions agrotechniques sur la teneur et la composition des HE, ce qui donne un aperçu du potentiel phytochimique de cette espèce et, par conséquent, de son potentiel biologique. D’autre part, l’obtention d’HE à partir de différentes parties de la plante maximise l’utilisation de matières premières végétales aux compositions chimiques diverses. La littérature fournit de nombreux exemples d’huiles essentielles obtenues à partir de différentes parties de plantes, présentant des compositions chimiques d’HE distinctes et des activités antioxydantes et antibactériennes diverses, comme dans le cas de Nepeta persica, Leonurus japonicus et Taxodium distichum. Par ailleurs, l’association d’HE diversifie la composition chimique et crée un potentiel de synergie entre les composants des HE, ce qui se traduit par une activité biologique distincte. Nous nous attendions donc, dans nos recherches, à des réactions différentes des diverses souches bactériennes face à des compositions chimiques d’HE différentes. En outre, des différences qualitatives importantes ont été mises en évidence entre les HE des parties aériennes et souterraines, lesquelles n’avaient pas été analysées auparavant au sein d’une même population d’arnica des montagnes.
De nombreux rapports de recherche ont montré une additivité ou une synergie modérée entre les HE et les antibiotiques, indiquant que les HE pourraient offrir des possibilités de réduction de l’utilisation des antibiotiques, ce qui répond aux avertissements de l’OMS relatifs à la menace de la résistance bactérienne aux antibiotiques, même à des concentrations nettement réduites. Cette approche constitue l’une des stratégies permettant de combattre à l’avenir les bactéries résistantes aux antibiotiques. De plus, l’utilisation d’HE associées entre elles et conjointement à des antibiotiques ou à un complément alimentaire révèle leurs nouvelles fonctions biologiques ainsi que de nouvelles voies et possibilités d’application en médecine, en pharmacie et dans diverses branches de l’industrie. La présente étude s’inscrit clairement dans cette tendance de recherche. Jusqu’à présent, l’HE d’arnica des montagnes n’a pas été analysée dans le contexte du renforcement de l’action des antibiotiques ; il s’agit donc d’une approche entièrement nouvelle. Les objectifs de cette étude étaient : (i) de caractériser la composition chimique des HE obtenues à partir des capitules, des rhizomes et des racines d’A. montana utilisés comme matière première pharmacopéique ; (ii) de mettre en évidence les effets de chaque type d’HE et de leurs associations sur l’activité antibactérienne ; et (iii) de mettre en évidence l’effet de la présence des huiles essentielles d’A. montana et de leurs associations avec des antibiotiques commerciaux sur leur activité antibactérienne.
2 Résultats et discussion
2.1 Caractéristiques chimiques des huiles essentielles
La composition chimique des huiles essentielles obtenues à partir des capitules (FH), des rhizomes (RH) et des racines (RO) d’arnica des montagnes est présentée dans le tableau 1. Les résultats de l’analyse ont montré des différences qualitatives dans la composition chimique des HE étudiées, distillées à partir des différentes parties des plantes. Cinquante-trois composants de l’huile essentielle obtenue à partir des capitules (FH) constituaient environ 97,49 %, 24 composants de l’huile essentielle obtenue à partir des rhizomes (RH) représentaient environ 97,51 %, et 21 composants de l’huile essentielle obtenue à partir des racines (RO) constituaient environ 96,74 % de la teneur totale en HE. L’huile essentielle FH était dominée par les hydrocarbures sesquiterpéniques (55,43 %), les hydrocarbures aliphatiques oxygénés (14,97 %) et les hydrocarbures monoterpéniques (10,41 %). L’E-caryophyllène, l’oxyde de caryophyllène, le germacrène D, l’acétate de farnésyle, le dodécanal et le décanal étaient les principaux composants des capitules d’arnica. La partie souterraine présentait une composition chimique complètement différente de celle des capitules. Quatorze composants d’HE étaient communs aux huiles essentielles FH et RH, et 11 composants étaient communs à FH et RO. Les huiles essentielles RH et RO étaient dominées par les composés phényliques aromatiques et les cétones, qui représentaient respectivement 83,77 % et 83,00 %. La composition chimique des huiles essentielles provenant des rhizomes et des racines était similaire, avec 21 composants communs aux deux HE. Le 2,5-diméthoxy-ρ-cymène, le 2,6-diisopropylanisole, la p-méthoxyheptanophénone, l’éther méthylique de thymol et l’α-isocomène étaient les principaux composants des huiles essentielles RH et RO.
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2.2 Différenciation des huiles essentielles
Les recherches ont montré que les différentes parties de la plante diffèrent par leur composition chimique et présentent des activités biologiques différentes. Les résultats des études sur l’HE d’A. montana présentés dans la littérature ont été obtenus lors de diverses expériences menées à des moments différents, dans des régions géographiques différentes et dans des conditions climatiques et pédologiques différentes ; le plus souvent, les chercheurs ont étudié Arnicae anthodium. Pour la première fois, nous mettons en évidence la variation importante de la composition des HE extraites de différents organes des mêmes plantes et, par conséquent, leurs activités biologiques différentes. L’E-caryophyllène, l’oxyde de caryophyllène, le germacrène D, l’acétate de farnésyle, le dodécanal et le décanal étaient les principaux composants de l’huile essentielle FH (tableau 1). Les trois dernières molécules citées n’ont pas été trouvées dans les huiles essentielles RH et RO. En revanche, le 2,5-diméthoxy-ρ-cymène, le 2,6-diisopropylanisole, la p-méthoxyheptanophénone, l’éther méthylique de thymol et l’α-isocomène étaient les principaux composants des HE RH et RO, mais pas de la matière FH.
La présente étude a montré que les huiles essentielles distillées à partir des capitules se caractérisaient par une composition chimique totalement différente de celle de l’HE provenant de la partie souterraine, tandis que les rhizomes et les racines étaient chimiquement similaires. Le nombre total de composants (plus de 50) et la proportion de monoterpènes et de sesquiterpènes concordent avec d’autres études menées sur l’arnica des montagnes dans différentes régions d’Europe. Toutefois, la composition des composants dominants diffère légèrement. Comme l’ont rapporté Vidic et al., les HE obtenues à partir des capitules d’A. montana étaient principalement composées d’acide n-hexadécanoïque (16,1 %), d’acide n-tétradécanoïque (10,5), d’acide décanoïque (5,0 %), de n-tricosane (4,2 %) et d’acide dodécanoïque (3,4 %). De leur côté, Judžentienė et Būdienė ont constaté que le (Z,Z)-géranyl-linalol (14,7 %), le (2E,6E)-farnésol (4,6 %), le n-eicosane (4,5 %), le (Z,E)-géranyl-linalol (3,2 %) et le docosane (3,0 %) étaient les principaux composants de l’HE obtenue à partir des capitules. Les présents résultats concordent avec les données présentées par Ristić et al. Les chercheurs ont montré que l’E-caryophyllène (31,5–34,6 %), le germacrène D (12,5–16,3 %), la trans-α-ionone (3,9–4,3 %) et le décanal (2,7–5,3 %) étaient les principaux composants, en fonction de la date de récolte des capitules. Dans nos études antérieures, en revanche, l’E-caryophyllène (11,1–18,0 %), l’acétate de farnésyle (13,5–16,1 %), le décanal (6,7–10,4 %), le germacrène D (5,8–8,9 %) et l’oxyde de caryophyllène (4,5–6,7 %) étaient les principaux composants, et la composition de l’HE dépendait de la maturité des capitules. Toutefois, une expérience portant sur l’incidence de la fertilisation foliaire au bore sur la teneur en huile essentielle et le rendement en composants des capitules a montré une modification de la composition chimique de l’HE, dont les principaux composants étaient l’oxyde de caryophyllène (12,9–18,2 %), l’E-caryophyllène (11,6–15,2 %), le germacrène D (5,1–8,8 %), le dodécanal (4,6–5,5 %), le cumène (4,5–5,7 %) et le décanal (2,3–5,5 %). De manière générale, la variation de la composition chimique de l’HE obtenue à partir des capitules résulte d’un certain nombre de facteurs, tels que le génotype des plantes cultivées, les conditions pédologiques, les conditions climatiques, l’âge des plantes, la phase de développement et les facteurs agrotechniques utilisés dans les expériences au champ, qui influencent la production et la composition des métabolites secondaires.
Dans la présente étude, les principaux composants des HE provenant des RH et RO d’arnica étaient le 2,5-diméthoxy-ρ-cymène (respectivement 49,8 % et 52,2 %), le 2,6-diisopropylanisole (19,3 % et 20,8 %), la p-méthoxyheptanophénone (14,6 % et 12,4 %), l’éther méthylique de thymol (6,5 % et 1,5 %) et l’α-isocomène (1,0 % et 2,2 %). Dans une étude menée par Pljevljakušić et al., 33 composants ont été identifiés dans l’HE distillée à partir des rhizomes et des racines de plantes âgées de trois ans, soit un nombre sensiblement supérieur à celui rapporté dans la présente étude. L’HE des plants d’arnica des montagnes poussant sous le climat subalpin de Serbie contenait principalement du 2,5-diméthoxy-p-cymène. Toutefois, la teneur de ce composant était sensiblement plus faible et s’élevait à environ 30 % dans l’HE obtenue à partir des rhizomes et à environ 40 % dans l’HE obtenue à partir des racines, par rapport aux données présentées dans cet article. Comme dans notre étude, les autres constituants principaux des huiles essentielles obtenues à partir des parties souterraines de la plante étaient des composés aromatiques : l’éther méthylique de thymol, la p-méthoxyheptanophénone et le 2,6-diisopropylanisole, dont les teneurs se situaient respectivement dans les intervalles de 9,6–10,6 %, 7,0–7,5 % et 12,8–14,1 %. En revanche, la composition chimique des HE d’A. montana analysées dans cette étude diffère largement, par le nombre de composants des HE, des données rapportées par Danila et al. Les auteurs ont montré que, parmi les 35 composés identifiés dans les HE provenant de rhizomes et de racines d’A. montana issus de populations originaires des Carpates orientales, les principaux constituants étaient le 3-t-butyl-1,2-diméthoxybenzène, le tétradécane, le thymol, le non-3-én-2-one et l’éther méthylique de thymol. On peut donc conclure que la composition chimique de l’HE provenant de plantes cultivées dans les conditions climatiques de la Pologne et de la Serbie diffère sensiblement de celle des huiles obtenues à partir de leurs habitats naturels dans les Carpates occidentales.
Une étude antérieure sur les caractéristiques chimiques et l’activité anticancéreuse de l’huile essentielle d’arnica des montagnes provenant des rhizomes et des racines a montré que le 2,5-diméthoxy-ρ-cymène était un composant nettement dominant. La part en pourcentage de ce composant et du 2,6-diisopropylanisole dans l’HE obtenue à partir des rhizomes et des racines était similaire aux données présentées dans la présente étude. Toutefois, des différences ont été observées dans la teneur des deux autres principaux composants de l’HE : la p-méthoxyheptanophénone et l’éther méthylique de thymol. La teneur en p-méthoxyheptanophénone de l’HE provenant respectivement des rhizomes et des racines de plantes d’A. montana âgées de quatre ans et analysées lors de l’expérience précédente était de 6,2 % et de 5,1 %, mais elle était plus de deux fois supérieure dans la présente étude. En revanche, la teneur en éther méthylique de thymol de l’HE provenant des organes souterrains était nettement plus faible.
2.3 Activité antibactérienne des huiles essentielles
Les résultats du test de diffusion en milieu solide et de la mesure des zones d’inhibition de la croissance bactérienne ont montré des réactions différentes des souches bactériennes analysées aux différents types d’HE (figure 1). Les résultats de l’ANOVA à un facteur ont montré un effet statistiquement significatif des différentes compositions d’HE sur l’inhibition de la croissance bactérienne dans le cas d’EF (F = 5,95, p < 0,01), d’EFC (F = 6,43, p < 0,01), d’EC (F = 4,82, p < 0,05), de PA (F = 10,71, p < 0,001) et de CA (F = 7,58, p < 0,01). Les différentes compositions d’HE n’ont eu aucun effet sur la zone d’inhibition de la croissance dans le cas de SA (F = 1,31, p > 0,05) et de SE (F = 1,81, p > 0,05). Les plus grandes zones (environ 120 mm) d’inhibition de la croissance de SE, EFC et CA ont été produites respectivement par RH, FH1:RH3 et RH. La différence de réaction bactérienne à l’HE distillée à partir des capitules, des rhizomes et des racines était clairement visible dans le cas de PA. Plus précisément, FH a produit des zones d’inhibition de la croissance statistiquement plus grandes que RH. Dans le cas d’EF, la zone d’inhibition de la croissance produite par FH3:RH1 était significativement plus petite que celles produites par RO, FH1:RH1 et FH1:RH3. Dans le cas d’EFC et de PA, l’association FH1:RH3 a présenté une activité antibactérienne supérieure à celles de RH et de RO et une activité similaire à celle de FH. Par ailleurs, dans le cas de PA, l’association de l’HE distillée à partir des capitules et des rhizomes (FH1:RH1) a entraîné la formation d’une zone d’inhibition de la croissance significativement plus grande que celle de RH et similaire à celle produite par FH. En revanche, dans le cas de CA, la zone d’inhibition de la croissance produite par l’association des HE distillées à partir des capitules et des rhizomes (FH1:RH1) était significativement plus petite que celles produites par RH et RO, mais similaire à celle du traitement FH.
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Les résultats de l’analyse en composantes principales de la composition chimique des huiles essentielles et des zones d’inhibition de la croissance bactérienne sont présentés dans la figure 2. Les valeurs propres du premier axe (46,53) et du second axe (18,74) ont indiqué la présence de deux gradients. Les deux premiers axes expliquaient 91,9 % de la variabilité (65,5 % pour l’axe 1 et 26,4 % pour l’axe 2). Les échantillons RH et RO, l’α-isocomène, le 2,6-diisopropylanisole, le 2,5-diméthoxy-p-cymène et la p-méthoxyheptanophénone, principaux composants de l’HE distillée à partir des rhizomes et des racines, ainsi que les étendues des zones d’inhibition de la croissance d’EC, CA, SE, EF, SA et EFC étaient positivement corrélés à l’axe 1, tandis que des corrélations négatives ont été observées pour l’E-caryophyllène, le germacrène D et 10 composants de l’huile essentielle contenue dans l’HE distillée à partir des capitules, dont la part dépassait 2 % (tableau 1, figure 2). Les zones d’inhibition de la croissance des souches bactériennes étaient donc déterminées par ces composants de l’huile essentielle. Deux groupes d’échantillons peuvent être distingués dans l’espace d’ordination (figure 2, tableau 1). Les échantillons RH et RO se situent à droite. La proximité des vecteurs représentant les principaux composants contenus dans l’HE obtenue à partir des organes souterrains et les zones d’inhibition de la croissance des bactéries EC, CA, SE, EF, SA et EFC démontre l’effet bactéricide de ces métabolites (2,5-diméthoxy-p-cymène, 2,6-diisopropylanisole, p-méthoxyheptanophénone) sur les souches bactériennes analysées (figure 2, tableau 1). Les principaux composants de FH forment quant à eux le second groupe et sont situés dans la partie gauche de l’espace d’ordination. La corrélation négative entre l’E-caryophyllène, le germacrène D, l’oxyde de caryophyllène et les autres composants contenus dans l’HE distillée à partir des capitules, d’une part, et les zones d’inhibition de la croissance des souches bactériennes, d’autre part, indique un rôle sensiblement moindre de ces métabolites en tant que molécules antibactériennes (figure 2).
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Les données obtenues lors du test de CMI ont confirmé les résultats précédemment obtenus avec le test de dépistage. Plus précisément, toutes les HE d’arnica des montagnes testées ont présenté un niveau d’activité antibactérienne similaire et se caractérisaient par les valeurs de CMI les plus faibles (c’est-à-dire les plus favorables) contre S. epidermidis (de 50 µg/mL à 200 µg/mL) et contre S. aureus (de 100 µg/mL à 400 µg/mL) (tableau 2). La CMI de toutes les huiles contre les entérocoques de référence et ceux associés aux infections hospitalières est restée au même niveau favorable de 200 µg/mL. En revanche, les HE testées ont présenté les valeurs de CMI les moins favorables, comprises entre 200 µg/mL et 800 µg/mL, contre les souches à Gram négatif E. coli et P. aeruginosa. Le spectre d’action des HE d’arnica des montagnes testées est donc davantage dirigé contre les souches à Gram positif que contre celles à Gram négatif, tout en restant, dans les deux cas, à un niveau modéré.
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La teneur et les relations des principaux composants de l’HE d’arnica des montagnes, en particulier l’E-caryophyllène, l’oxyde de caryophyllène, le germacrène D et le 2,5-diméthoxy-p-cymène, sont similaires au profil chimique des HE d’espèces telles qu’Origanum vulgare, Eupatorium intermedium, Centaurea intricata, Copaifera langsdorffii et Eupatorium triplinerve. L’E-caryophyllène est un composé sesquiterpénique présentant un large éventail d’activités anti-inflammatoires, antioxydantes, antibiotiques et antiparasitaires, ainsi que des propriétés anticancéreuses et analgésiques. Moghrovyan et Sahakyan ont montré que les mécanismes d’action possibles de l’E-caryophyllène reposaient sur la désorganisation de la membrane cellulaire bactérienne. Il a été constaté que l’oxyde de caryophyllène présentait un large éventail d’activités antioxydantes, antiparasitaires et insecticides. Les huiles essentielles de nombreuses espèces de la famille des Verbenaceae constituent des sources alternatives d’E-caryophyllène et de germacrène D présentant une activité antibactérienne. Le potentiel thérapeutique du 2,5-diméthoxy-p-cymène et de l’éther méthylique de thymol, composés isolés à partir des huiles essentielles d’A. montana, a été présenté par Jain et al. Comme indiqué ci-dessus, les principaux composants et leurs interactions contribuaient à leur activité biologique ; toutefois, la compréhension de l’efficacité et du mécanisme d’action de chaque constituant des HE est essentielle pour prévoir l’activité biologique globale des HE. Cela revêt une grande importance dans le cadre de nos études futures sur l’activité antibactérienne des huiles essentielles d’A. montana.
2.4 Activité cytotoxique
Toutes les huiles essentielles d’A. montana ont présenté une cytotoxicité dépendante de la concentration envers les fibroblastes humains normaux (BJ), les concentrations testées les plus élevées (500–62,5 µg/mL) produisant des effets cytotoxiques (figure 3). À 31,25 µg/mL, FH, RH, RO et FH1:RH1 ont entraîné une diminution statistiquement significative de la viabilité des fibroblastes par rapport au témoin, mais les valeurs sont restées supérieures au seuil de cytotoxicité communément admis de 70 %. FH3:RH1 a présenté une diminution statistiquement significative similaire dès 15,625 µg/mL, tandis que FH1:RH3 n’a pas entraîné de changement significatif à cette concentration. De plus, toutes les HE analysées, appliquées dans les intervalles de concentrations définis, ont eu un effet positif sur la croissance des cellules BJ en augmentant leur viabilité. Il est intéressant de noter qu’une augmentation de 20–30 % de la viabilité cellulaire par rapport au témoin a été observée à la concentration de 0,97–3,90 µg/mL dans le cas de l’huile essentielle obtenue par distillation des racines. Dans une étude antérieure, nous avons montré que les huiles essentielles distillées à partir des akènes, des rhizomes et des racines n’avaient aucun effet sur le déclenchement de la mort cellulaire dans les fibroblastes normaux. L’induction de l’apoptose (mais pas de l’autophagie ni de la nécrose) à un niveau de 28,5–32,3 % dans des lignées cellulaires humaines de glioblastome multiforme T98G et d’astrocytome anaplasique MOGGCCM constituait un résultat prometteur dans le contexte de l’activité anticancéreuse. Ainsi, cette expérience a montré que la toxicité des extraits issus des huiles essentielles d’arnica des montagnes obtenues à partir des parties souterraines de la plante dépend fortement de la concentration utilisée, et que leurs composés semblent constituer les groupes de molécules intéressantes les plus prometteurs et les plus sûrs (dans des solutions adéquates) pour de futures applications biomédicales.
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Les préparations contenant des extraits d’A. montana sont largement utilisées dans des produits cosmétiques à application topique (crèmes, pommades, gels), notamment pour atténuer l’inflammation, le gonflement et les douleurs post-traumatiques et pour favoriser la cicatrisation des plaies. Des études cliniques ont montré que le gel d’A. montana était aussi efficace et bien toléré que l’ibuprofène dans le traitement de l’arthrose de la main. Une revue systématique a confirmé les effets bénéfiques des préparations à base d’arnica sur la réduction de la douleur et des symptômes inflammatoires associés aux blessures sportives et aux interventions chirurgicales. En outre, des études physicochimiques ont montré que les lactones sesquiterpéniques, c’est-à-dire les constituants actifs de l’arnica, sont capables de traverser l’épiderme et d’atteindre les couches dermiques.
Bien que la norme ISO 10993-5 ait été initialement élaborée pour évaluer la biocompatibilité des matériaux médicaux, elle est également largement utilisée comme cadre de référence pour les extraits végétaux et les substances bioactives in vitro. Selon cette norme, un élément d’essai est considéré comme non cytotoxique si la viabilité cellulaire reste ≥ 70 % par rapport au témoin non traité. Dans l’évaluation de la sécurité des cosmétiques, conformément aux lignes directrices du SCCS et de l’OCDE, un seuil de viabilité ≥ 80 % est généralement retenu pour les applications cutanées. Dans notre étude, les valeurs de viabilité des fibroblastes sont restées dans ces intervalles, ce qui confirme que les huiles essentielles d’A. montana testées satisfont aux critères de sécurité communément admis et peuvent être considérées comme potentiellement sûres pour de futures applications cosmétiques et pharmaceutiques.
2.5 Interactions entre les huiles essentielles d’Arnica montana, leurs associations et les antibiotiques contre des bactéries sélectionnées
Les données indiquent clairement que la présence d’huiles essentielles d’A. montana dans les interactions avec des antibiotiques commerciaux exerce un effet bénéfique sur leur activité antibactérienne (tableau 3). Plus précisément, les interactions testées entre les HE et les antibiotiques ont montré un effet additif bénéfique — une synergie (7 associations), une synergie partielle (21 associations) ou aucun effet — ni activité synergique ni activité antagoniste (35). Aucune des associations n’a eu d’effet antagoniste réciproque. Une synergie est apparue entre FH1:RH3 ou RH et le métronidazole ou l’amoxicilline contre les deux souches de staphylocoques et les entérocoques de référence. Une synergie partielle a également été obtenue le plus souvent dans une interaction similaire : FH1:RH3, RO, FH1:RH1 et RH avec le métronidazole et avec l’amoxicilline. Un tel effet additif bénéfique des associations sélectionnées est important du point de vue des applications, car il pourrait permettre une réduction des concentrations d’antibiotiques utilisées, répondant ainsi aux avertissements de l’OMS relatifs à la menace de la résistance bactérienne aux antibiotiques. L’OMS avertit que, si les pratiques liées à l’utilisation excessive et inappropriée des antibiotiques ne sont pas modifiées, la résistance bactérienne aux antibiotiques continuera de progresser et qu’il n’existera plus de solutions pour les maladies infectieuses actuellement traitables.
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La diminution de l’efficacité des antibiotiques et la résistance aux antimicrobiens constituent l’une des principales menaces mondiales pour la santé publique. La recherche de solutions alternatives est donc l’un des principaux défis de la pharmacie et de la médecine modernes. La synergie entre les huiles essentielles et les antibiotiques est un concept nouveau qui a récemment été décrit par de nombreux chercheurs. Une étude menée par Drioiche et al. a révélé des interactions synergiques entre des huiles essentielles d’origan et certains antibiotiques. Dans la lutte contre les bactéries résistantes, les huiles essentielles d’O. compactum et d’O. elongatum se sont révélées prometteuses lorsqu’elles étaient associées à des antibiotiques. Maggio et al. ont observé des interactions positives entre l’HE de Thymbra capitata et des antibiotiques. Comme l’ont rapporté Taibi et al., la meilleure action synergique a été mise en évidence par l’association de l’HE de Ptychotis verticillata avec l’amoxicilline contre Micrococcus luteus et par l’association de cette HE avec l’ampicilline contre E. coli. De leur côté, Zych et al. ont observé plus fréquemment une synergie entre l’enrofloxacine et l’HE de lavande qu’entre l’enrofloxacine et l’HE de cannelle ou l’HE de clou de girofle.
De nombreux rapports ont montré une additivité ou une synergie modérée, indiquant que les HE pourraient offrir des possibilités de réduction de l’utilisation des antibiotiques, ce qui répond aux avertissements de l’OMS relatifs à la menace de la résistance bactérienne aux antibiotiques. Cette approche constitue l’une des stratégies permettant de combattre les bactéries résistantes aux antibiotiques, de limiter à l’avenir l’utilisation des antibiotiques et leur rejet dans l’environnement. L’étude présentée dans cet article s’inscrit clairement dans cette tendance de recherche. La synergie entre l’huile essentielle d’arnica des montagnes obtenue à partir de différentes parties de la plante et les antibiotiques a été analysée pour la première fois. Les résultats présentés dans le tableau 3 ont montré que l’association de l’HE aux antibiotiques, de même que l’association du mélange d’HE distillées à partir des capitules et des rhizomes aux antibiotiques, avait un effet très positif. Cependant, les valeurs de FICI ont mis en évidence différents niveaux d’interaction contre les bactéries sélectionnées. Il a été montré que l’HE distillée à partir des rhizomes présentait le plus fort potentiel d’utilisation en association avec des antibiotiques.
De nombreuses études ont examiné l’interaction synergique des antibiotiques avec diverses associations d’huiles essentielles de plantes médicinales. Karadağ et al. ont rapporté une interaction synergique entre une association d’huile essentielle de Foeniculum vulgare et d’amoxicilline contre les agents pathogènes E. faecalis et E. coli. Par ailleurs, les résultats obtenus par Soulaimani et al. ont montré que les différentes HE d’Ammodaucus leucotrichus (dominée par le L-périllaldéhyde, le D-limonène et l’angélate de bornyle), de Thymus vulgaris (dominée par le thymol, le p-cymène et le γ-terpinène) et de Lavandula maroccana (dominée par le carvacrol), ainsi que leur mélange optimal, présentaient une synergie totale avec cet antibiotique contre S. aureus et P. aeruginosa. Dans la présente étude, FH a présenté une synergie partielle avec l’amoxicilline contre S. epidermidis et C. acnes. De même, une interaction synergique partielle entre l’amoxicilline et RO contre S. aureus, S. epidermidis et C. acnes a été observée. Une attention particulière doit être accordée à l’interaction entre le métronidazole et RH, car leur association a présenté une interaction synergique contre S. aureus et S. epidermidis et une synergie partielle contre C. acnes. Ibrahim et al. ont souligné le rôle d’extraits de plantes telles que Symphytum officinale et Panax ginseng contre Porphyromonas gingivalis, appliqués séparément et en association avec le métronidazole. Les résultats rapportés par Piasecki et al. ont montré des effets additifs ou synergiques entre l’HE de Mentha spp. et le métronidazole contre des souches de référence et des souches cliniques d’Helicobacter pylori. Les interactions synergiques entre une HE de plantes médicinales et l’antibiotique courant qu’est la ciprofloxacine ont également été étudiées. Il a été constaté que l’association de la ciprofloxacine à l’HE de Thymus vulgaris renforçait l’activité de l’antibiotique et affectait la viabilité des cellules du biofilm. Par ailleurs, l’activité antibactérienne de l’HE de Croton tetradenius et son effet synergique avec la ciprofloxacine ont été présentés par Siqueira et al., et une interaction synergique entre la ciprofloxacine et l’huile essentielle de Rosmarinus officinalis a été rapportée par El Alama et al. Dans la présente étude, une interaction synergique entre la ciprofloxacine et FH contre C. acnes a été détectée. En outre, l’interaction synergique partielle de RH et de RO avec l’amoxicilline et le métronidazole contre ces souches bactériennes indique qu’il est nécessaire de poursuivre les recherches sur l’utilisation de RH et de RO en association avec des antibiotiques afin d’accroître leur efficacité contre d’autres souches de bactéries microaérobies.
Les recherches sur les effets synergiques de mélanges d’huiles essentielles et d’antibiotiques conventionnels ont donné des résultats particulièrement prometteurs pour inhiber la croissance de souches résistantes. Des études récentes ont mis en évidence l’important potentiel thérapeutique des huiles essentielles dans la lutte contre les bactéries résistantes aux antibiotiques. La nouvelle tendance de recherche concernant l’utilisation de produits naturels consiste à optimiser les effets antibactériens des huiles essentielles en améliorant les proportions des mélanges d’HE afin d’obtenir une efficacité antibactérienne et antioxydante maximale. Les présents résultats constituent la première étape montrant que différentes proportions de mélange de deux types d’HE d’arnica des montagnes peuvent présenter des efficacités antibactériennes différentes (tableau 3). Les résultats ont montré que l’association FH1:RH3 (63 composants d’HE, avec une proportion de 75 % de RH) présentait une synergie totale avec l’amoxicilline et une synergie partielle avec la ciprofloxacine contre S. aureus, tandis qu’aucun effet n’a été observé entre FH et les deux antibiotiques ni entre RH et ces antibiotiques. De même, l’association FH1:RH3 a présenté une synergie totale avec le métronidazole et une synergie partielle avec l’amoxicilline contre E. faecalis, tandis qu’aucun effet distinct n’a été détecté entre FH et les deux antibiotiques ni entre RH et ces antibiotiques. Par ailleurs, l’association FH1:RH3 a présenté une synergie totale avec l’amoxicilline contre S. epidermidis, tandis qu’aucun effet n’a été observé entre FH et l’amoxicilline et qu’une synergie partielle a été relevée entre RH et l’amoxicilline contre S. epidermidis. La présence probable d’un plus grand nombre de métabolites et les nouvelles compositions des HE ont entraîné des interactions différentes entre les composants des HE, ainsi qu’entre les composants des HE et les antibiotiques. Par conséquent, dans les recherches futures sur les propriétés biologiques des huiles essentielles d’arnica, il conviendra de veiller à accroître leur efficacité en optimisant les mélanges.
3 Matériel et méthodes
3.1 Collecte de la matière première et dosage de la teneur en huile essentielle
La matière première provenait de plants d’arnica des montagnes âgés de quatre ans, poussant sur le sol podzolique gris-brun d’un champ expérimental de l’Université des sciences de la vie de Lublin, dans l’est de la Pologne (51°31′39,5″ N, 22°45′6,7″ E). Les capitules ont été récoltés en phase de pleine floraison. Cette phase se caractérise par la teneur en HE la plus élevée dans l’inflorescence. Les parties souterraines ont quant à elles été prélevées après la récolte des capitules. Après la récolte, les capitules, les rhizomes et les racines ont été transférés au laboratoire et séchés à l’air à 25 °C. La matière première a été séchée, préparée et distillée selon des procédures décrites précédemment. Les huiles essentielles ont été recueillies au-dessus de l’eau, séparées, séchées sur du sulfate de sodium anhydre et conservées à l’obscurité à 4 °C avant l’analyse par GC-MS. L’analyse a été réalisée avec quatre répétitions.
3.2 Analyse par GC-MS
La séparation chromatographique des constituants volatils a été réalisée à l’aide d’un appareil Varian 4000 GC–MS/MS (Varian, Palo Alto, Californie, États-Unis) équipé d’une colonne capillaire VF-5ms (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm). Le programme de température du four a débuté à 50 °C, puis la température a été portée à 250 °C à raison de 4 °C/min. La température de l’injecteur a été réglée à 250 °C, le volume d’injection était de 5 µL et le rapport de division de 1:50. Les spectres de masse ont été enregistrés en mode impact électronique (EI) à 70 eV, avec une température de source ionique de 200 °C, sur une plage de 40–870 m/z. Chaque type d’huile essentielle a été analysé en trois exemplaires, selon des procédures décrites précédemment.
3.3 Analyse qualitative et quantitative
Les composés ont été identifiés sur la base de critères complémentaires :
Les indices de rétention (IR) ont été calculés à l’aide de l’équation de van den Dool–Kratz par rapport à une série homologue de n-alcanes (C₈–C₂₈) analysés dans des conditions chromatographiques identiques. Les valeurs expérimentales des IR ont été comparées aux données de la littérature pour des phases stationnaires non polaires et aux bases de données d’indices de rétention du NIST.
La comparaison des spectres de masse a été effectuée avec la bibliothèque EI-MS du NIST. Un composé était considéré comme identifié de manière fiable lorsque son IR expérimental ne différait pas de plus de ±10–15 unités des valeurs de référence et que l’indice de similarité spectrale dépassait environ 85–90 %.
Une vérification manuelle supplémentaire a été effectuée par inspection visuelle des ions diagnostiques et des profils de fragmentation, conformément aux recommandations standard pour l’analyse des huiles essentielles et aux recommandations plus récentes concernant les recherches dans les bibliothèques de spectres de masse.
Les composés qui satisfaisaient à la fois aux critères de l’IR et de la MS ont été classés comme identifiés, tandis que ceux qui ne remplissaient qu’une seule condition ont été considérés comme provisoirement identifiés. Les abondances relatives ont été calculées à partir des aires des pics de GC sans correction par un facteur de réponse. Pour l’étalonnage des valeurs des IR et la quantification de la composition relative, les n-alcanes C₁₂ et C₁₉ ont été utilisés comme étalons internes conformément à des procédures publiées précédemment.
Les HE suivantes ont été utilisées dans toutes les expériences : huile essentielle obtenue à partir des capitules (FH), huile essentielle obtenue à partir des rhizomes (RH), huile essentielle obtenue à partir des racines (RO), association des huiles essentielles obtenues à partir des capitules et des rhizomes dans un rapport 1:1, FH1:RH1, association des huiles essentielles obtenues à partir des capitules et des rhizomes dans un rapport 1:3 (FH1:RH3), et association des huiles essentielles obtenues à partir des capitules et des rhizomes dans un rapport 3:1 (FH3:RH1).
3.4 Activité antibactérienne
3.4.1 Microorganismes et matériel
L’étude a été menée avec les souches aérobies suivantes : bactéries à Gram positif : Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterococcus faecalis PCM 896 et isolats cliniques d’Enterococcus faecalis (infection d’une culture de plaie — w.c.i.) provenant du service de gastro-entérologie ; bactéries à Gram négatif : Escherichia coli ATCC 25992 et Pseudomonas aeruginosa ATCC 278532 ; ainsi que Cutibacterium acnes ATCC 11827. Toutes les souches sont correctement conservées au département de biochimie et de biotechnologie de l’Université médicale de Lublin, en Pologne.
Les milieux microbiologiques suivants ont été utilisés : Müller-Hinton (M-H), gélose, Oxoid Ltd. (Basingstoke, Royaume-Uni), et bouillon, Oxoid Ltd. (Basingstoke, Royaume-Uni).
Tous les essais antimicrobiens ont été réalisés dans des conditions aseptiques au cours de trois expériences indépendantes, chacune menée en trois exemplaires, et ont fourni des résultats cohérents pour l’ensemble des répétitions.
3.4.2 Dépistage de l’activité antibactérienne des huiles essentielles végétales — essai de diffusion sur gélose
Pour l’évaluation préliminaire, des solutions d’huile essentielle ont été préparées dans du DMSO à une concentration de 10 mg/mL. La gélose de Mueller-Hinton a été versée dans des boîtes de Petri conformément au protocole du fabricant. Une suspension bactérienne équivalant à l’étalon de McFarland 0,5 (1,5 × 10⁸ UFC/mL) a été préparée et étalée uniformément sur la surface de la gélose à l’aide d’un écouvillon stérile. Les zones désignées des boîtes ont été exposées à 10 µL d’échantillons d’huile essentielle d’arnica (correspondant à 100 µg). Les boîtes ont ensuite été incubées en conditions aérobies à 37 °C pendant 24 h. Après l’incubation, le diamètre des zones d’inhibition entourant les échantillons d’huile a été déterminé à l’aide d’une règle microbiologique.
3.4.3 Détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) des huiles essentielles
La CMI, définie comme la plus faible concentration d’un composé qui empêche une croissance microbienne visible, a été déterminée par la méthode standard de microdilution en bouillon dans des microplaques à 96 puits. Les huiles essentielles ont été préparées sous forme de dilutions en série dans le bouillon, allant de 1 600 µg/mL à 6,25 µg/mL. Chaque puits a été inoculé avec 2 µL de la suspension bactérienne ajustée à 0,5 McFarland. L’essai comprenait des témoins positifs pour confirmer la viabilité bactérienne, des témoins négatifs pour garantir la stérilité et des témoins de réactifs pour tenir compte de la couleur intrinsèque des huiles essentielles dans les différentes dilutions. Les plaques ont été incubées dans des conditions appropriées, et les valeurs de CMI ont été relevées sur la base de l’absence de croissance visible.
3.4.4 Interactions synergiques entre les HE et les antibiotiques
Les effets synergiques des huiles d’arnica et des antibiotiques commerciaux ont été évalués par la méthode de l’échiquier, fondée sur la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI). Plus précisément, l’amoxicilline (Polfa Tarchomin, Varsovie, Pologne), le métronidazole et la ciprofloxacine (tous deux de Polpharma S.A., Starogard Gdański, Pologne) ont été testés. Des solutions mères et des dilutions sériées au demi des antibiotiques, ainsi que des dilutions d’échantillons d’huile correspondant à quatre fois la valeur de la CMI, ont été préparées. Au total, 50 µL de bouillon ont été répartis dans chaque puits des plaques de microdilution. Le premier antibiotique testé dans l’association a été dilué en série verticalement, tandis que l’échantillon d’huile d’arnica a été dilué horizontalement dans la plaque à 96 puits. Ensuite, 100 µL d’inoculum bactérien à une concentration de 1,5 × 10⁸ UFC/mL ont été ajoutés dans chaque puits, et les plaques ont été incubées dans des conditions appropriées. Le dispositif en échiquier ainsi obtenu comprenait chaque association des agents testés ainsi que la détermination de la CMI de chaque agent utilisé individuellement. L’indice de concentration fractionnaire inhibitrice (FICI) a été calculé pour chaque association de concentrations des agents à l’aide de la formule suivante : FICI = (CMI_A/B/CMI_A) + (CMI_B/A/CMI_B), où CMI_A est la CMI de l’agent A seul, CMI_A/B est la CMI de l’agent A associé à l’agent B et CMI_B, et CMI_B/A est définie de manière analogue pour l’agent A. Les valeurs de FICI obtenues indiquent une synergie totale (FICI ≤ 0,5), une synergie partielle (0,5 < FICI ≤ 0,75), l’absence d’effet (0,75 < FICI ≤ 2) ou un antagonisme (FICI > 2) entre deux agents.
3.5 Activité cytotoxique
3.5.1 Expériences de culture cellulaire
Les tests de cytotoxicité ont été réalisés à l’aide de la lignée de fibroblastes humains normaux BJ (CRL-2522, ATCC-LGC Standards, Teddington, Royaume-Uni). Les cellules ont été cultivées dans le milieu essentiel minimum d’Eagle (American Type Culture Collection-LGC, Teddington, Royaume-Uni), supplémenté avec 10 % de sérum bovin fœtal (Pan-Biotech GmbH, Aidenbach, Allemagne), 100 U/mL de pénicilline et 0,1 mg/mL de streptomycine (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, États-Unis). Les cultures ont été maintenues à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂ (Heraeus Cytoperm 2, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis).
3.5.2 Viabilité cellulaire
Les huiles essentielles ont d’abord été dissoutes dans du DMSO afin d’obtenir une solution mère à une concentration de 100 mg/mL. Des dilutions en série des huiles ont ensuite été préparées dans le milieu de culture EMEM contenant 2 % de FBS afin d’obtenir des concentrations finales comprises entre 0,97 et 500 µg/mL. Les fibroblastes humains (BJ) ont été ensemencés dans des plaques à 96 puits à une densité de 1 × 10⁴ cellules par puits dans 100 µL de milieu de culture. Après 24 h d’incubation à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂, le milieu de culture a été remplacé par 100 µL des composés testés aux concentrations indiquées (n = 3). Parallèlement, des témoins DMSO ont été inclus à toutes les concentrations correspondantes afin d’exclure toute cytotoxicité potentiellement induite par le solvant. Après 24 h d’exposition aux composés testés, la viabilité cellulaire a été évaluée au moyen du test MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium ; Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, États-Unis). Les composés et les témoins DMSO ont été retirés, puis 100 µL de milieu de culture contenant 1 mg/mL de MTT ont été ajoutés dans chaque puits. Après une incubation de 3 h, 100 µL de la solution de SDS (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, États-Unis) préparée dans du HCl 0,01 M (Avantor Performance Materials Poland S.A., Gliwice, Pologne) ont été ajoutés dans chaque puits. Les plaques ont ensuite été incubées pendant 12 h supplémentaires, après quoi l’absorbance a été mesurée à 570 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (BioTek Synergy, Vinooski, Vermont, États-Unis). Les résultats ont été exprimés en pourcentage d’absorbance par rapport au témoin négatif de cytotoxicité (cellules cultivées dans un milieu sans huiles essentielles), considéré comme représentant une viabilité de 100 %.
3.6 Analyse statistique
Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel Statistica 6.0 (Stat. Soft, Inc., Cracovie, Pologne). Une ANOVA à un facteur, suivie de tests de Tukey, a été utilisée. Les différences ont été considérées comme significatives à p < 0,05. L’analyse en composantes principales (ACP) a été appliquée pour expliquer les relations entre les composants des différents types d’huiles essentielles obtenues par hydrodistillation et les zones d’inhibition de la croissance bactérienne induites par les HE d’arnica des montagnes et leurs associations. Avant l’ACP, les données ont été centrées et transformées par logarithme. Les analyses ont été effectuées à l’aide du progiciel statistique MVSP, version 3.1.
4 Conclusions
Les différentes parties de la plante, à savoir les capitules (Arnicae anthodium), les rhizomes (Arnicae rhizome) et les racines (Arnicae radix), peuvent être des déterminants de la composition de l’huile essentielle. Pour la première fois, nous mettons en évidence la variation importante de la composition des HE provenant de différents organes des mêmes plantes et, par conséquent, leurs activités antibactériennes différentes. L’E-caryophyllène, l’oxyde de caryophyllène, le germacrène D, l’acétate de farnésyle, le dodécanal et le décanal étaient les principaux composants de l’huile essentielle des capitules. Les trois dernières molécules citées n’ont pas été trouvées dans la partie souterraine. En revanche, le 2,5-diméthoxy-p-cymène, le 2,6-diisopropylanisole, la p-méthoxyheptanophénone, l’éther méthylique de thymol et l’α-isocomène étaient les principaux composants des huiles essentielles provenant des rhizomes et des racines. Une telle diversité de compositions des HE atteste de leur activité antibactérienne et de leur grande fonctionnalité quant à l’utilisation des métabolites secondaires de cette espèce végétale. De plus, la synergie entre différents types d’huiles essentielles d’arnica des montagnes et leurs mélanges, d’une part, et les antibiotiques, d’autre part, contre différentes souches bactériennes a été analysée pour la première fois. Les données indiquent clairement que la présence d’HE d’arnica en interaction avec des antibiotiques commerciaux (amoxicilline, ciprofloxacine, métronidazole) exerce un effet bénéfique sur leur activité antibactérienne. Les résultats de cette étude soulignent la nécessité de mener des recherches supplémentaires sur l’activité biologique des huiles essentielles d’arnica des montagnes, seules et en association avec des antibiotiques, contre d’autres souches bactériennes, sur l’utilisation des huiles essentielles comme facteur expérimental dans des études in vivo, et sur l’exploration approfondie de leurs mécanismes d’action.