Des extraits distincts d’Arnica montana L. modulent de différentes manières l’activation des lymphocytes T humains par une inhibition différentielle des voies NFκB et NFAT
Référence : Frontiers in Immunology 2025. — PMC12568507 · DOI 10.3389/fimmu.2025.1655212 Type : étude in vitro · Plante : Arnica des montagnes · Propriété → Immunomodulation Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit. Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Arnica montana L. (arnica) est utilisée depuis longtemps pour traiter l’inflammation et les lésions des tissus mous, mais ses mécanismes immunomodulateurs restent largement inexplorés. Dans cette étude, nous avons examiné les effets d’extraits distincts d’arnica — issus de différentes parties de la plante (racine ou plante entière) et de différents procédés de fabrication — sur des lymphocytes T humains primaires. Nous avons également comparé leurs effets à ceux des composés purs hélénaline et thymol. Tous les extraits ont inhibé l’activation et la prolifération des lymphocytes T. Cela a pu être relié à une diminution de la réponse à l’IL-2 due à une expression réduite de CD25 (chaîne IL-2Rα), accompagnée d’une baisse de la production d’IL-2. L’analyse transcriptomique (nCounter) et l’analyse d’enrichissement de jeux de gènes ont révélé que les extraits ciblent des voies de signalisation clés du récepteur des lymphocytes T (TCR). Sur le plan mécanistique, l’extrait hydroéthanolique de racine a sélectivement inhibé la liaison de NFκB à l’ADN, tandis que l’extrait aqueux fermenté a principalement supprimé l’expression génique dépendante de NFAT. L’extrait hydroéthanolique de plante entière a exercé un effet modéré sur les deux voies. Ces résultats identifient les extraits d’arnica comme des modulateurs prometteurs de la signalisation du TCR humain et étayent leur potentiel dans la régulation des réponses inflammatoires induites par les lymphocytes T, avec des implications pour la cicatrisation musculaire et les maladies inflammatoires chroniques.
Introduction
Depuis des siècles, les préparations d’Arnica montana L. (arnica) sont utilisées pour traiter l’inflammation et favoriser la guérison des traumatismes fermés, tels que les contusions et les ecchymoses. Au total, environ 150 substances thérapeutiquement actives ont été identifiées dans les différentes parties de l’arnica. Son mode d’action anti-inflammatoire a principalement été attribué aux lactones sesquiterpéniques (LS) qu’elle contient, dont l’hélénaline est le représentant le plus important. Le facteur nucléaire « amplificateur de chaîne légère kappa » des lymphocytes B activés (NFκB) régule l’expression de divers gènes liés à l’immunité et à l’inflammation et a été identifié comme une cible moléculaire de l’hélénaline dans la lignée de leucémie T Jurkat. L’hélénaline est principalement contenue dans les capitules, tandis que le thymol (un phénol monoterpénique) et ses dérivés sont enrichis dans l’huile essentielle des parties souterraines de la plante. Une autre étude a décrit un effet inhibiteur de la teinture de fleurs d’arnica sur la libération d’IL-1β et de TNFα dépendante du facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT), après stimulation de cellules mononucléées du sang périphérique par du LPS.
Le système immunitaire humain remplit la fonction importante de protéger l’organisme contre les agents pathogènes envahissants et d’éliminer les infections émergentes. Par ailleurs, divers types de cellules immunitaires, notamment les lymphocytes T CD4+, interviennent de manière cruciale dans le processus de cicatrisation musculaire en réponse à un traumatisme. Ils envahissent le site lésé de manière spatio-temporellement contrôlée et établissent rapidement un milieu pro-inflammatoire qui contribue de façon essentielle à la réparation normale des tissus. Les lymphocytes T CD4+ jouent un rôle régulateur clé et coordonnent le processus complexe de guérison en sécrétant des cytokines pro- ou anti-inflammatoires, selon le sous-type de lymphocyte T auxiliaire. En outre, les lymphocytes T régulateurs favorisent la régénération tissulaire en sécrétant des facteurs de croissance tels que l’amphiréguline et interagissent directement avec les cellules souches musculaires activées afin de maintenir leur prolifération et leur survie avant leur différenciation. Toutefois, la présence prolongée de lymphocytes T CD4+ et CD8+, associée à une inflammation persistante, est une caractéristique du retard de réparation musculaire.
Par conséquent, comprendre les effets des préparations d’arnica sur les fonctions des lymphocytes T peut apporter de nouvelles informations et des explications mécanistiques permettant d’évaluer de manière critique leurs effets anti-inflammatoires et leur potentiel à favoriser la régénération tissulaire. Les publications étudiant le potentiel immunomodulateur des extraits d’arnica sont actuellement rares, ce qui souligne le besoin urgent de recherches supplémentaires dans ce domaine. En particulier, aucune étude n’a examiné l’effet des préparations d’arnica sur l’activation des lymphocytes T humains primaires après reconnaissance de l’antigène par le récepteur antigénique spécifique des lymphocytes T. Afin d’évaluer les interactions potentielles avec les immunomodulateurs conventionnels, les effets moléculaires de l’arnica sur les lymphocytes T humains doivent également être élucidés.
Les lymphocytes T ont besoin de deux signaux indépendants pour être activés. Dans les conditions physiologiques, le premier signal est transmis par la liaison du récepteur antigénique spécifique des lymphocytes T (TCR) au complexe peptide-CMH correspondant sur les cellules présentatrices d’antigène (CPA). Pour le second signal, un récepteur costimulateur tel que CD28, exprimé par les lymphocytes T, doit se lier à son ligand CD80 ou CD86 sur les CPA. L’activation des lymphocytes T induit leur prolifération et diverses fonctions effectrices, dont la production de cytokines. Grâce à leurs récepteurs de chimiokines, les lymphocytes T peuvent en outre migrer le long d’un gradient chimioattractant. Cette fonction leur permet d’envahir les sites d’infection ou de lésion.
Dans ce travail, nous avons caractérisé, aux niveaux fonctionnel et moléculaire, les effets de trois extraits d’arnica fabriqués selon des procédés différents sur des lymphocytes T primaires du sang périphérique humain (PBT).
En parallèle, les effets des composés purs hélénaline et thymol sur les PBT humains ont été déterminés. Nous décrivons un potentiel immunomodulateur pour chacun des candidats testés. De manière surprenante, malgré des effets fonctionnels similaires, différents mécanismes moléculaires impliquant la voie de signalisation NFκB et/ou NFAT ont été mis au jour. La caractérisation des extraits par LC-MS/MS a confirmé la variation présumée de leur composition phytochimique, résultant des différences de partie végétale, de solvant d’extraction et de procédé d’extraction utilisés. Ces différences phytochimiques pourraient expliquer leurs modes d’action moléculaires différents.
Matériel et méthodes
Extraits végétaux et substances
Trois extraits d’arnica préparés différemment ont été directement comparés dans cette étude. L’extrait aqueux fermenté (WALA Heilmittel GmbH, Bad Boll, Allemagne) a été fabriqué conformément à la méthode de production 33c définie dans la Pharmacopée homéopathique allemande officielle (GHP). En bref, du matériel végétal frais fleuri et fragmenté (matériel végétal frais:miel:eau:lactose monohydraté selon un rapport massique de 100:0,75:125:0,75) subit un processus de fermentation (7 j), suivi d’une période de maturation de six mois à 15 °C.
L’extrait liquide hydroéthanolique (Weleda AG, Arlesheim, Suisse) a été produit conformément aux instructions de fabrication consignées dans la méthode 1.1.4 de la Ph. Eur. (GHP 2b). En bref, des plantes entières fraîches, fleuries et fragmentées ont été mélangées à de l’éthanol à 62 % (m/m) et mises à macérer dans des récipients fermés à température ambiante pendant 10 à 30 jours, avec agitation répétée. Le mélange de macération a été pressé et filtré afin d’obtenir la teinture finale, dont la concentration en éthanol était de 30 % (m/m).
La teinture mère d’arnica (DHU-Arzneimittel GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Allemagne) a été fabriquée conformément à la méthode de production 1.1.8 consignée dans la Ph. Eur. (GHP 4a). Ainsi, au total, 1 part de parties souterraines séchées d’Arnica montana L., fraîchement pulvérisées (numéro de tamis 710), a été extraite avec 10 parts d’éthanol à 86 % (m/m). Dans un premier temps, la poudre a été soigneusement mélangée avec une partie de l’éthanol à 86 % (m/m), de manière à imbiber complètement la matière végétale. Le mélange a été laissé au repos pendant environ 24 h (pour permettre le prégonflement de la drogue). Il a ensuite été transféré dans un percolateur et soumis à une percolation lente avec le reste de l’éthanol, à température ambiante. Une fois la percolation terminée, le résidu a été pressé et le liquide exprimé a été réuni au percolat. Les liquides réunis ont finalement été filtrés. Les trois extraits d’arnica ont été utilisés dans les expériences à une dilution non toxique de 1:1 000. Les extraits d’arnica étant des mélanges complexes de substances, la concentration des substances individuelles n’est pas indiquée.
L’acide 3-O-caféoylquinique pur (Extrasynthese), l’acide 3,5-di-O-caféoylquinique (Extrasynthese), l’acide 3,4,5-tri-O-caféoylquinique (MedChemExpress), le thymol (Sigma-Aldrich), l’hélénaline (Focus Biomolecules) et le TPCA1 (Abcam) ont été dissous dans du DMSO, puis des aliquotes ont été conservées à –80 °C.
Cellules primaires et lignées cellulaires
Les PBT humains ont été fraîchement isolés à partir de sang total hépariné de donneurs sains. Les PBMC ont été obtenues par centrifugation sur gradient de densité au moyen de FicoLite-H (Linaris). Des PBT purs ont été isolés des PBMC par sélection négative au moyen du Pan T Cell Isolation Kit, human (Miltenyi Biotec).
Les PBT et les cellules Jurkat E6.1 (ATCC®) ont été cultivés dans du milieu RPMI 1640 (Gibco) supplémenté en FCS (10 % de FCS, v/v, PAN-Biotec) et en L-glutamine (2 mM, Gibco). Les cellules Jurkat ont été repiquées trois fois par semaine.
Traitement par des extraits d’arnica ou des composés purs, stimulation in vitro et analyse de la viabilité cellulaire
Avant la stimulation, les PBT ou les cellules Jurkat ont été préincubés avec le produit testé (Ferm, Tota, Radix, hélénaline [0,25 μM] ou thymol [500 μM], respectivement) ou le véhicule (H2O, EtOH à 0,1 % ou DMSO à 0,1 %) pendant 1 h à 37 °C. Les échantillons traités par les produits ont été préparés de manière à contenir ≤ 0,1 % d’EtOH ou 0,1 % de DMSO, afin de permettre une comparaison directe avec le témoin solvant.
Les cellules ont été stimulées au moyen d’anticorps anti-CD3 (20 ng/ml, clone OKT3, produit dans la Section d’immunologie moléculaire, Institut d’immunologie, Hôpital universitaire de Heidelberg) et anti-CD28 (75 ng/ml, clone CD28.2, BD Biosciences) immobilisés sur plaque. Selon le paramètre mesuré, les cellules ont été stimulées pendant différentes durées, comme indiqué. La viabilité cellulaire a été évaluée par exclusion du 7-AAD (BioLegend). Un seuil de ≥ 90 % de cellules vivantes a été fixé pour définir les concentrations non toxiques des produits.
Test de prolifération des lymphocytes T
Afin de suivre la division cellulaire, les PBT ont été marqués avec 1 μM d’ester succinimidylique de carboxyfluorescéine (CFSE ; Thermo Fisher Scientific) pendant 15 min à 37 °C, puis stimulés pendant 72 h. La prolifération des lymphocytes T a été analysée par dilution du CFSE en cytométrie en flux (BD™ LSRII).
Expérience de restauration par l’IL-2
Les PBT ont été marqués au CFSE, laissés sans stimulation ou prétraités avec un extrait d’arnica ou le véhicule pendant 1 h, puis activés par des anticorps anti-CD3/CD28 pendant 72 h, en présence ou en l’absence de 40 U/ml d’IL-2 humaine recombinante. La prolifération des lymphocytes T a été évaluée par dilution du CFSE.
Test de migration des lymphocytes T
La capacité migratoire des lymphocytes T a été évaluée à l’aide d’inserts Transwell™ à 96 puits (Corning) présentant des pores de 5 μm. Les cellules placées dans le compartiment supérieur ont été autorisées à migrer pendant 90 min vers le SDF-1α (100 ng/ml, R&D Systems) présent dans le compartiment inférieur. Les cellules ayant migré dans la chambre inférieure ont été quantifiées par cytométrie en flux (BD™ LSRII). Le pourcentage de cellules migrantes a été calculé à partir d’un échantillon témoin représentant 100 % de migration, pour lequel la suspension cellulaire avait été ajoutée au compartiment inférieur.
Test de sécrétion des cytokines
Douze cytokines différentes (IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-22, IFN-γ et TNF-α), libérées par les PBT au cours d’une stimulation de 24 h, ont été simultanément quantifiées dans le surnageant de culture cellulaire au moyen du panel LEGENDplex™ Human Th Cytokine (12-plex, BioLegend), conformément aux instructions du fabricant.
Cytométrie en flux
L’expression des marqueurs de surface des PBT a été analysée après 24 h de stimulation à l’aide des anticorps directement marqués suivants : anti-CD3-FITC (clone SK7, BioLegend), anti-CD25-APC (clone M-A251, BioLegend) et anti-CD69-FITC (clone FN50, BioLegend). La cytométrie en flux a été réalisée conformément aux recommandations.
L’IL-2 intracellulaire a été marquée après 24 h de stimulation, dont 4 h de traitement par GolgiStop™ (BD Biosciences). Les PBT ont été fixés au PFA et perméabilisés à la saponine (Sigma-Aldrich) avant le marquage avec un anticorps anti-IL-2-APC (clone MQ1-17H12, BioLegend).
La phosphorylation de NFκB p65 a été évaluée après stimulation des PBT pendant 30 min. Les cellules ont été fixées avec du Cytofix™ Fixation Buffer préchauffé (BD Biosciences) et perméabilisées avec du Phosflow™ Perm Buffer III (BD Biosciences). L’anticorps anti-phospho-NFκB p65 (S529) (clone K10-895.12.50, BD Biosciences) a été utilisé pour le marquage.
Les anticorps non liés ont été éliminés par trois lavages et les échantillons ont été acquis sur un cytomètre en flux LSRII (BD Biosciences). L’analyse des données a été effectuée avec le logiciel FlowJo version 10 (FlowJo).
Contrôle de la qualité et quantification de l’ARN
Les PBT ont été stimulés pendant 4 h et l’ARN total a été isolé au moyen du Direct-zol™ RNA Microprep Kit (Zymo Research), conformément aux instructions du fabricant. La qualité et la quantité de l’ARN isolé pour l’analyse de l’expression génique par nCounter® ont été analysées avec un spectrophotomètre NanoDrop2000c (Thermo Scientific). En outre, les échantillons d’ARN ont été quantifiés avec le fluorimètre Qubit (Thermo Fisher Scientific) et l’intégrité de l’ARN a été évaluée sur l’Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Les échantillons d’ARN ont été conservés à –80 °C jusqu’à leur traitement ultérieur.
Analyse de l’expression génique par nCounter®
Les analyses de l’expression des gènes cibles par nCounter® ont été réalisées dans la plateforme centrale nCounter® sur un système SPRINT, au moyen de la technologie nCounter® (nanoString Technologies). La technologie nCounter® permet une analyse multiplexée de l’expression génique reposant sur l’hybridation simultanée et la quantification numérique de sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence. L’expression de 579 gènes liés à l’immunité, ainsi que de 15 gènes domestiques servant de référence interne, a été analysée avec le panel nCounter® Human Immunology V2 (nanoString Technologies).
L’évaluation des données, la correction du bruit de fond et la normalisation ont été réalisées avec le logiciel nSolver™ Analysis Software (version 4.0) fourni par nanoString Technologies (https://nanostring.com/products/analysis-solutions/ncounter-analysis-solutions). L’algorithme NormFinder (v0.953, téléchargement du complément MS Excel à l’adresse https://www.moma.dk/software/normfinder) a été utilisé pour identifier, à partir des données brutes, les gènes domestiques les plus stables parmi les 15 gènes de référence interne inclus. Les gènes présentant une valeur de stabilité inférieure à 0,5 ont été utilisés pour la normalisation dans nSolver™. À l’aide de GraphPad Prism 9, une analyse par tests t multiples (Benjamini et Hochberg) a été réalisée afin d’identifier les gènes significativement régulés à la hausse ou à la baisse, avec une valeur de p ≤ 0,05.
Les données normalisées d’expression génique ont été utilisées pour l’analyse d’enrichissement de jeux de gènes (GSEA) des voies KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, https://www.genome.jp/kegg/), réalisée par la plateforme centrale NGS. La GSEA a servi à déterminer si des listes (ou jeux) définies de gènes présentaient un biais statistiquement significatif dans leur distribution au sein d’une liste de gènes classés, au moyen des progiciels de R, version 4.2.2. L’analyse des voies a été effectuée avec le package fgsea et le package enrichment browser.
Analyse de la translocation nucléaire
La translocation nucléaire de NFκB a été analysée dans les PBT après 30 min de stimulation à l’aide du kit Amnis® NFκB Translocation (Luminex Corporation), conformément au protocole du fabricant. Les signaux fluorescents ont été détectés avec le cytomètre en flux d’imagerie Amnis® ImageStream®X Mk II (Luminex Corporation) et les données ont été analysées au moyen du logiciel IDEAS® Analysis Software (Luminex Corporation). L’inhibiteur de la kinase IκB TPCA1 (10 μM) a servi de témoin positif. La stratégie de sélection appliquée est présentée dans [ ].
Test de liaison à l’ADN
Les PBT ont été stimulés pendant 30 min et des lysats nucléaires ont été préparés. Après 15 min de gonflement dans une solution tampon hypotonique, les membranes cellulaires ont été rompues par ajout de Nonidet P-40 Assay Reagent (Cayman Chemical). L’extrait cytoplasmique a été éliminé et les noyaux isolés ont été lysés dans un tampon de lyse nucléaire par agitation sur une plateforme pendant 30 min.
L’activité de liaison à l’ADN du NFκB nucléaire a été étudiée avec le kit NFκB (p65) Transcription Factor Assay (Cayman Chemical), fondé sur un ELISA, conformément aux instructions du fabricant. Les valeurs moyennes d’absorbance obtenues après soustraction du blanc ont été normalisées par rapport à la concentration protéique des lysats nucléaires, déterminée au moyen du Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit (Thermo Scientific), conformément au protocole du fabricant.
Test rapporteur de luciférase NFAT
Les cellules Jurkat 6.1 ont été transfectées avec un plasmide rapporteur de luciférase NFAT fondé sur le vecteur pGL2-Promoter (NFAT-pGL2-Promoter Vector), au moyen du Human T Cell Nucleofector™ Kit (Lonza). Le lendemain, les cellules ont été préincubées avec le produit ou le véhicule pendant 1 h, puis stimulées pendant 6 h. Après lyse des cellules dans un tampon de lyse pendant 15 min à 37 °C, 20 μl de lysat ont été incubés avec 100 μl de Beetle-Juice contenant de la D-luciférine (PJK), pendant 5 min à température ambiante. La luminescence a été mesurée avec un lecteur de microplaques Tecan Ultra. Après soustraction du blanc, les valeurs de luminescence ont été normalisées par rapport à la concentration protéique des lysats, déterminée avec le Pierce™ 660 nm Protein Assay Kit (Thermo Scientific), conformément aux instructions du fabricant.
Mesure des concentrations intracellulaires de calcium
Le colorant Indo-1 AM (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé comme capteur de calcium pour quantifier les concentrations intracellulaires de calcium par cytométrie en flux (BD LSR Fortessa™). Les PBT ont été marqués avec 2 μg/ml d’Indo-1 pendant 45 min à 37 °C. Les concentrations basales de calcium ont été mesurées pendant 1 min, puis 20 ng/ml d’anticorps anti-CD3 (clone OKT3, produit dans la Section d’immunologie moléculaire, Institut d’immunologie, Hôpital universitaire de Heidelberg) ont été ajoutés. La mesure a été poursuivie pendant 4 min, après quoi l’activation des lymphocytes T a été induite par l’ajout de 8 μg/ml d’anticorps de chèvre anti-souris (Jackson ImmunoResearch) afin de réticuler CD3. L’influx calcique induit par la stimulation a été enregistré en continu pendant 14 min, avant qu’un influx calcique maximal ne soit induit par l’ajout de 4 μg/ml d’ionomycine (Sigma-Aldrich). Après 2 min supplémentaires, l’analyse a été arrêtée. Les données ont été analysées dans FlowJo en calculant le rapport entre le signal de l’Indo-1 AM lié au calcium (~400 nm) et celui de l’Indo-1 AM non lié au calcium (~475 nm). Les résultats sont présentés sous forme d’aire sous la courbe (ASC).
Immunoblot
Des lysats cellulaires totaux ont été préparés à partir des PBT après 30 min de stimulation. Les protéines ont été séparées selon leur taille dans un gel de polyacrylamide-SDS à 14 %, puis transférées sur une membrane PVDF Immobilon-FL présentant des pores de 0,45 μm (Merck Millipore). Les protéines totales et phosphorylées ont été détectées à l’aide des anticorps primaires suivants : anti-cofiline (1:10 000, polyclonal, produit dans la Section d’immunologie moléculaire, Institut d’immunologie, Hôpital universitaire de Heidelberg), anti-phospho-cofiline (S3) (1:1 000, polyclonal, Cell Signaling), anti-L-plastine (1:1 000, clone LPL4A.1, Thermo Fisher Scientific), anti-phospho-L-plastine (S5) (1:1 000, monoclonal, produit dans la Section d’immunologie moléculaire, Institut d’immunologie, Hôpital universitaire de Heidelberg) et anti-GAPDH (1:5 000, polyclonal, Thermo Fisher Scientific). Des IgG anti-lapin-IRDye® 800CW (1:10 000, LI-COR) et des IgG anti-souris-IRDye® 680RD (1:10 000, LI-COR) ont été utilisées comme anticorps secondaires. Le signal fluorescent a été détecté à l’aide du système d’imagerie Odyssey® (LI-COR). L’intensité du signal a été évaluée avec le logiciel Image Studio™ Lite (LI-COR) et normalisée par rapport à la protéine domestique GAPDH.
Caractérisation phytochimique des extraits végétaux
Deux lots de chacun des trois extraits décrits ont été traités. Tous les échantillons ont été soumis aux ultrasons pendant 2 min, dilués à une concentration approximative de 5 mg de résidu sec/ml (les concentrations finales des extraits utilisés allaient de 5,26 à 6,80 mg de résidu sec/ml ; voir [ ]), chacun dans le mélange de solvants correspondant, puis centrifugés pendant 10 min à 13 000 tr/min avant leur transfert dans des flacons pour GC. Pour les dilutions, les compositions de solvants indiquées par les fabricants ont été utilisées dans chaque cas. Une exception a été faite pour l’extrait Tota : la teneur plus élevée en éthanol, de 62 %, correspondant aux conditions initiales d’extraction, a été utilisée afin de garantir une solubilité maximale des composés présents.
[ ]
L’analyse LC-MS/MS a été réalisée sur un spectromètre de masse à piège ionique Finnigan LCQ-Duo équipé d’une source d’ionisation par électrospray (ESI) (ThermoQuest), couplé à un système HPLC Thermo Scientific Accela (pompe MS plus, passeur automatique d’échantillons et détecteur PDA plus) (ThermoQuest), avec une colonne EC 150/3 Nucleodur 100-3 C18ec (Macherey-Nagel). Un gradient d’eau et d’acétonitrile (ACN), contenant chacun 0,1 % d’acide formique, a été appliqué de 5 % à 30 % d’ACN en 60 min, puis jusqu’à 95 % d’ACN au cours des 60 min suivantes, à 30 °C. Le débit était de 0,5 ml/min et le volume d’injection de 20 µl. Tous les échantillons ont été mesurés en modes ESI+ et ESI−. Le spectromètre de masse a fonctionné avec une tension capillaire de 10 V (ESI+) ou −10 V (ESI−), une température de source de 240 °C et de l’azote de haute pureté comme gaz de gainage et gaz auxiliaire, à des débits respectifs de 80 et 40 (unités arbitraires). Les ions ont été détectés dans une plage de masse de m/z 50 à 2 000. Une énergie de collision de 35 % a été utilisée en MS2 pour la fragmentation. Les données d’absorption PDA ont été mesurées sous forme de spectres sommés entre 200 et 600 nm. L’acquisition et l’analyse des données ont été réalisées avec le logiciel Xcalibur™ 2.0.7 (Thermo Scientific).
Les lots de chaque extrait présentaient une composition identique ; par conséquent, un seul lot de chaque extrait a été utilisé pour toutes les études ultérieures. Les données obtenues pour les échantillons des lots retenus parmi les trois extraits d’arnica ont été traitées manuellement. Les composés phytochimiques ont été déterminés par identification provisoire à partir de la littérature indiquée et de nos propres calculs fondés sur les profils de fragmentation. Dans ce cadre, les résultats ESI− ont principalement servi à déterminer les dérivés de l’acide caféoylquinique, et les résultats ESI+ les lactones sesquiterpéniques (hélénalines et dihydrohélénalines).
[ ]
[ ]
La teneur en thymol des extraits d’arnica a été étudiée par chromatographie sur couche mince (CCM) selon Rossetti et al., avec quelques adaptations. En bref, une plaque de CCM de gel de silice 60 F254 (Merck) et un mélange cyclohexane:éther diéthylique (70:30) comme phase mobile ont été utilisés pour la séparation. À titre de référence, 5 µg de thymol ont été déposés ; 20 µl des extraits ont été utilisés. Les substances d’essai ont été déposées sous forme de bandes de 15 mm et la plaque a été développée sur une distance d’environ 7,5 cm. La plaque a été traitée avec la solution d’anisaldéhyde R, chauffée à 100 °C pendant 10 min et examinée à la lumière du jour.
Statistiques
Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel GraphPad Prism 9. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± ESM. Les différences numériques significatives par rapport à l’échantillon témoin du solvant correspondant ont été déterminées au moyen d’une analyse de variance (ANOVA) à un facteur ou, en présence de valeurs manquantes, d’une analyse à effets mixtes, avec le test post hoc de Dunnett. Les différences présentant une valeur de p ≤ 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives (*p ≤ 0,05 ; **p ≤ 0,01 ; ***p ≤ 0,001 ; ****p ≤ 0,0001). Seules ont été évaluées les expériences montrant une différence significative entre l’échantillon non stimulé et le témoin H2O stimulé. Par conséquent, les significativités de cette comparaison ne sont pas indiquées dans les graphiques.
Résultats
Les extraits d’arnica préparés différemment se distinguent par leur composition phytochimique
Les extraits végétaux constituent des mélanges complexes de différents ingrédients bioactifs. Afin de déterminer quelles substances sont les plus abondantes et pourraient être principalement responsables des effets induits par les extraits, les trois extraits d’arnica ont été caractérisés par LC-MS/MS, puis les composés phytochimiques ont fait l’objet d’une identification provisoire. Les chromatogrammes obtenus avec le réseau de photodiodes (PDA) des extraits indiquent déjà d’importantes différences de composition phytochimique. Ces différences apparaissent encore plus clairement dans les chromatogrammes ioniques totaux (TIC) en mode négatif résumés dans [ ]. Elles peuvent être attribuées aux différents solvants, aux différentes méthodes d’extraction ainsi qu’aux différentes parties de la plante. Alors que l’extrait aqueux Ferm (en haut) contient principalement des composés hydrophiles, l’extrait hydroéthanolique Tota (au milieu) comprend aussi des substances hydrophobes, qui sont éluées plus tard dans le chromatogramme HPLC. Ferm et Tota ont tous deux été préparés à partir de matériel provenant de la plante entière, tandis que, pour Radix (en bas), seules les parties souterraines et un solvant à plus forte teneur en éthanol ont été utilisés, ce qui aboutit à une composition différente, comportant davantage de composés hydrophobes que les deux autres extraits.
Probablement en raison du traitement du matériel végétal au cours des procédures d’extraction, il n’a pas été possible d’identifier provisoirement un grand nombre des composés détectés à partir de la littérature disponible. Néanmoins, les dérivés de l’acide caféoylquinique (mono-, di- et tri-) [ [ ] (1)] ont pu être identifiés comme l’un des principaux groupes de substances dans Tota et Radix. Les concentrations les plus élevées de ces composés ont été trouvées dans Radix.
[ ]
Le mode positif a été utilisé pour déterminer les lactones sesquiterpéniques. Une vue d’ensemble sélective est fournie dans [ ]. Les structures chimiques des composés déterminés sont présentées dans [ ] (5–14). Les concentrations les plus élevées d’hélénalines et de dihydrohélénalines ont été trouvées dans l’extrait Ferm. Des concentrations plus faibles et un nombre moindre de dérivés de lactones sesquiterpéniques ont été trouvés dans Tota, à l’exception du méthacrylate de dihydrohélénaline [ [ ] (12)]. Dans Radix, presque aucun dérivé de lactone sesquiterpénique n’a pu être identifié.
Une situation différente se dégage pour le thymol [ [ ] (2)] et les dérivés du thymol détectés [ [ ] (3, 4)]. Le trihydroxythymol [détecté en ESI− (3)] et le 10-hydroxy-8,9-époxy-thymolisobutyrate [détecté en ESI+ (4)] sont présents dans les trois extraits étudiés. Le thymol et les terpénoïdes lipophiles apparentés (déterminés par CCM, [ ]) sont principalement présents dans Radix et, à des concentrations plus faibles, dans Tota. En revanche, aucun thymol n’a été détecté dans Ferm (limite de détection : 0,2 µg). La teneur estimée en trihydroxythymol était plus élevée dans Ferm, tandis que le 10-hydroxy-8,9-époxy-thymolisobutyrate était plus abondant dans Tota.
En résumé, les principaux composés détectés dans Ferm étaient des lactones sesquiterpéniques, tandis que les dérivés de l’acide caféoylquinique et le thymol étaient enrichis dans Radix. Tota présentait un mélange de toutes les classes de substances, mais à plus faible teneur. Les dérivés du thymol mentionnés ont été trouvés dans les trois extraits, à des concentrations différentes. Tous les extraits contenaient des composés supplémentaires qui n’ont pas pu être identifiés.
Les extraits d’arnica inhibent l’activation et la prolifération des lymphocytes T humains primaires
Afin d’analyser les effets des préparations d’arnica sur les fonctions des lymphocytes T, trois extraits d’arnica préparés différemment ont été sélectionnés et leurs effets sur les PBT ont été directement comparés. Les PBT ont été préincubés avec une dilution non toxique à 1:1 000 de chaque extrait ou du véhicule, puis costimulés par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (stimulation CD3xCD28). Ce mode d’activation reproduit la reconnaissance de l’antigène sur les CPA par l’intermédiaire du TCR et du récepteur costimulateur CD28. L’activation des lymphocytes T se traduit par une augmentation de l’expression en surface de CD25 et de CD69. Par rapport au témoin véhicule H2O, l’extrait aqueux fermenté de plante entière (Ferm) a significativement diminué l’intensité moyenne de fluorescence (MFI) de CD25 par cellule. Une inhibition encore plus forte a été observée après traitement par l’extrait hydroéthanolique de plante entière (Tota) et la teinture mère de racine (Radix), par rapport au témoin véhicule éthanol (EtOH). Le pourcentage de cellules CD25+ n’a toutefois été significativement réduit que par l’extrait Radix. L’extrait Radix a, en outre, diminué la MFI de CD69 et le pourcentage de PBT exprimant CD69. Un tel effet n’a pas été observé après traitement par les extraits Ferm ou Tota.
[ ]
L’expression de CD25 est directement liée à la prolifération des lymphocytes T, car CD25 constitue une sous-unité du récepteur du facteur autocrine de croissance des lymphocytes T, l’interleukine-2 (chaîne IL-2Rα), nécessaire à la formation d’un IL-2R de haute affinité. En accord avec la diminution des taux de CD25 en surface, les trois extraits d’arnica testés ont inhibé la prolifération des lymphocytes T. Comme pour l’expression de CD25, les extraits Tota et Radix se sont révélés plus efficaces que l’extrait Ferm pour inhiber la prolifération des lymphocytes T.
Les extraits d’arnica inhibent la production d’IL-2, mais l’ajout d’IL-2 ne restaure pas la prolifération des lymphocytes T
Outre l’expression de CD25, les lymphocytes T doivent produire le facteur de croissance autocrine IL-2 pour pouvoir proliférer. L’IL-2 libérée par les PBT, avec ou sans traitement préalable par les produits, a donc été quantifiée dans les surnageants de culture cellulaire au moyen de LEGENDplex™. Comme prévu, la stimulation CD3xCD28 a entraîné une augmentation de la teneur en IL-2 des surnageants par rapport aux témoins non stimulés. Les extraits Ferm, Tota et Radix ont chacun diminué significativement, et dans une mesure similaire, la concentration d’IL-2 dans le surnageant. Afin de déterminer si le traitement par les extraits inhibe la production de cytokines ou plutôt leur exportation, un marquage intracellulaire de l’IL-2 a été effectué et analysé par cytométrie en flux. Les trois préparations d’arnica ont significativement diminué le pourcentage de PBT contenant de l’IL-2 intracellulaire. Il a ainsi été confirmé que les extraits interfèrent avec la production d’IL-2.
[ ]
Afin de déterminer si la réduction de la production d’IL-2 en présence des extraits d’arnica exerce un effet déterminant sur la prolifération des lymphocytes T, une expérience de restauration a été réalisée. Le milieu de culture cellulaire a donc été supplémenté en IL-2 humaine recombinante. Cependant, l’IL-2 ajoutée de manière exogène n’a pas pu rétablir le taux normal de division cellulaire. Il convient de noter que la fonctionnalité de l’IL-2 exogène a été confirmée par son effet inducteur de prolifération sur des PBT traités à la phytohémagglutinine (PHA). Ainsi, l’inhibition de la réponse à l’IL-2, due à une induction réduite du récepteur de l’IL-2 (CD25), semblait être la principale raison de la diminution de la prolifération des lymphocytes T en présence des trois préparations d’arnica.
Les effets des extraits d’arnica sur les PBT humains ne sont pas reproduits par l’acide caféoylquinique pur (mono-, di- ou tri-)
Afin de déterminer si les acides caféoylquiniques contribuaient, au moins en partie, aux effets de Tota et de Radix, leurs effets sur la fonction des PBT ont été testés sous forme pure. Une titration de chaque produit a été réalisée afin de déterminer la plage de concentrations optimale. L’acide 3-O-caféoylquinique (3-CQA), également appelé acide chlorogénique, n’a exercé aucun effet significatif sur l’expression de CD25 et de CD69 après 24 h de stimulation. Aucune des concentrations testées (10–100 μM) n’a eu d’effet cytotoxique à ce moment. La prolifération des lymphocytes T (72 h de stimulation) n’a pas non plus été significativement modifiée par le 3-CQA. La plus forte concentration non toxique après 72 h de stimulation était de 25 μM.
De même, les effets d’un traitement par l’acide 3,5-di-O-caféoylquinique (3,5-diCQA ; 10–100 μM) sur l’expression des marqueurs d’activation des lymphocytes T et sur leur prolifération ont été analysés. Contrairement aux extraits d’arnica, 10 μM et 25 μM de 3,5-diCQA ont même entraîné une augmentation de l’expression de CD25 par rapport au témoin DMSO. Les autres concentrations testées n’ont exercé aucun effet significatif. Une concentration de 10 μM de 3,5-diCQA a également augmenté l’expression de CD69, tandis qu’aucune modification significative n’était observable entre 25 et 100 μM. Aucune des concentrations de 3,5-diCQA testées n’a significativement affecté la capacité de prolifération des lymphocytes T. Par rapport au 3-CQA, le 3,5-diCQA s’est révélé légèrement plus toxique pour les PBT. Après 24 h de stimulation, des concentrations allant jusqu’à 75 μM de 3,5-diCQA n’ont pas réduit la viabilité cellulaire en dessous de 90 %, tandis qu’après 72 h, la plus forte concentration non toxique a été définie à 25 μM.
En raison d’une cytotoxicité sensiblement plus élevée que celle des acides mono- et dicaféoylquiniques, la plage de concentrations utilisée pour tester l’effet de l’acide 3,4,5-tri-O-caféoylquinique (3,4,5-triCQA) sur les PBT a dû être ajustée à 0,5–5 μM. L’analyse de son influence sur l’expression en surface de CD25 et sur la migration n’a révélé aucun effet significatif. Seule la concentration cytotoxique de 5 μM de 3,4,5-triCQA a entraîné une réduction significative de la prolifération des lymphocytes T. Contrairement aux tests de 24 h, pour lesquels jusqu’à 2,5 μM de 3,4,5-triCQA n’étaient pas toxiques, une concentration maximale de 1 μM était fiable pour les expériences de 72 h. Ainsi, les effets des extraits d’arnica sur l’activation et la prolifération des PBT humains n’ont pas été reproduits par l’acide caféoylquinique pur (mono-, di- ou tri-).
Le thymol et l’hélénaline inhibent l’expression de CD25, la production d’IL-2 et la prolifération des lymphocytes T de manière similaire aux extraits d’arnica
Nous avons ensuite comparé les effets des composés purs thymol (Th) et hélénaline (Hel) sur l’activation de PBT humains purifiés à ceux observés pour les différents extraits d’arnica. À cette fin, les PBT ont été préincubés avec de l’hélénaline (0,25 μM), du thymol (500 μM) ou le témoin solvant correspondant (DMSO), puis costimulés par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (stimulation CD3xCD28). L’hélénaline et le thymol ont tous deux significativement inhibé l’expression de la sous-unité CD25 du récepteur de l’IL-2. Ces effets sont similaires à ceux observés après traitement par les différents extraits d’arnica. L’expression de CD69, significativement réduite par Radix, a également été réduite par le thymol, bien que seulement sous forme de tendance. Comme Ferm, l’hélénaline n’a pas affecté l’expression de CD69 sur les PBT.
[ ]
Tous les extraits d’arnica ont significativement réduit le pourcentage de cellules IL-2+ après 24 h de stimulation CD3xCD28. Le même effet a été observé après traitement par le thymol ou l’hélénaline lors de la costimulation CD3xCD28. En accord avec ce résultat et comme les extraits d’arnica, le thymol et l’hélénaline ont entraîné une diminution de la prolifération des lymphocytes T. Il convient de noter qu’aucune de ces substances n’a affecté la viabilité cellulaire. Là encore, la prolifération des lymphocytes T n’a pas pu être restaurée par l’ajout exogène d’IL-2 (données non présentées).
Les extraits d’arnica, le thymol et l’hélénaline n’affectent ni la phosphorylation de la LPL ni la déphosphorylation de la cofiline, deux signaux costimulateurs
La costimulation des lymphocytes T induit des signaux costimulateurs intracellulaires nécessaires au remaniement dynamique du cytosquelette d’actine, à la formation d’une synapse immunologique mature après reconnaissance de l’antigène sur les cellules présentatrices d’antigène (CPA), ainsi qu’à l’induction de la production d’IL-2 et de la prolifération des lymphocytes T. En réponse à la costimulation des lymphocytes T, la protéine de liaison à l’actine L-plastine (LPL) est activée par phosphorylation de son résidu sérine 5 et peut ensuite remplir sa fonction cruciale dans la formation de la synapse immunologique entre les lymphocytes T et les CPA, ainsi que dans l’augmentation des marqueurs d’activation CD25 et CD69 à la surface des lymphocytes T. Un autre événement induit par la costimulation et nécessaire à l’activation des lymphocytes T est la déphosphorylation, en sérine 3, de la cofiline, protéine qui sectionne et dépolymérise l’actine. Comme tous les extraits d’arnica ainsi que le thymol et l’hélénaline ont inhibé la production d’IL-2 et la prolifération des lymphocytes T, leur influence sur l’activation des protéines de liaison à l’actine LPL et cofiline a ensuite été étudiée. L’analyse par Western blot de lysats totaux de lymphocytes T préparés après 30 min de stimulation CD3xCD28 a révélé que ni les extraits d’arnica, ni le thymol ou l’hélénaline n’exerçaient d’effet significatif sur la phosphorylation de la LPL et la déphosphorylation de la cofiline dans les PBT humains.
[ ]
Le thymol et l’hélénaline, mais pas les extraits d’arnica, inhibent la migration des lymphocytes T
Outre la prolifération, la migration cellulaire constitue une fonction importante des lymphocytes T, car elle leur permet d’atteindre, par exemple, les sites d’infection ou d’inflammation dans tout l’organisme humain. Afin de déterminer si les extraits d’arnica influencent la capacité migratoire des PBT, un test Transwell™ a été réalisé. Dans ce test, les cellules sont placées dans le compartiment supérieur, séparé par une membrane semi-perméable du compartiment inférieur contenant le chimioattractant. Les lymphocytes T ayant migré vers la chimiokine facteur 1α dérivé des cellules stromales (SDF-1α), présente dans la chambre inférieure, ont été quantifiés par cytométrie en flux. Les extraits d’arnica n’ont pas affecté la migration des PBT vers le SDF-1α. En revanche, les composés purs thymol (500 μM) et hélénaline (0,25 μM) ont significativement inhibé la migration des PBT. Comme indiqué précédemment, la viabilité cellulaire, détectée par marquage au 7-AAD, n’a pas été affectée par ces substances. Le constat que les extraits d’arnica n’influençaient pas la capacité migratoire des PBT a, en outre, confirmé qu’ils n’affectaient pas la viabilité des lymphocytes T.
Les extraits d’arnica, le thymol et l’hélénaline interviennent différemment dans la signalisation du récepteur des lymphocytes T et inhibent la production de cytokines
Afin d’obtenir une compréhension globale du mécanisme moléculaire sous-jacent à l’action des produits, une analyse de l’expression génique a été réalisée avec la plateforme nCounter®. Cette technique permet de comparer l’expression génique dans différents échantillons d’ARN en comptant simultanément les molécules individuelles d’ARNm du jeu de gènes étudié, sans amplification préalable. Au moyen du panel Human Immunology V2 couvrant 579 gènes liés à l’immunité, l’expression génique dans les PBT prétraités avec différents extraits d’arnica, du thymol ou de l’hélénaline, puis costimulés par CD3xCD28, a été comparée à celle de l’échantillon témoin du solvant correspondant (H2O ou EtOH, respectivement). Dans les diagrammes en volcan, les gènes significativement régulés à la baisse sont indiqués en bleu et ceux significativement régulés à la hausse en rouge. Après traitement par Ferm, Tota ou l’hélénaline, la majorité des gènes significativement régulés étaient régulés à la baisse (en bleu). Fait intéressant, Radix et le thymol ont aussi montré un certain nombre de gènes régulés à la hausse (en rouge). Un résumé des gènes significativement régulés est fourni dans [ ].
[ ]
L’évaluation de l’analyse nCounter®, telle que présentée dans les diagrammes en volcan, a révélé que l’expression de plusieurs gènes de cytokines était régulée à la baisse par les trois extraits, ainsi que par le thymol et l’hélénaline, mais avec des spécificités différentes. Afin d’étudier la production de ces cytokines au niveau protéique, une analyse LEGENDplex™ des surnageants de culture cellulaire après 24 h de stimulation a été réalisée. Outre l’IL-2, les extraits Ferm, Tota et Radix ont significativement diminué les concentrations d’IL-10, d’IL-22 et d’IFN-γ. Les cytokines IL-13, IL-17A et TNF-α ont été significativement diminuées par les extraits Tota et Radix, mais pas par l’extrait Ferm. Comme Tota et Radix, le thymol et l’hélénaline ont significativement diminué les concentrations de toutes ces cytokines dans les surnageants de culture cellulaire. L’IL-5 n’a été significativement réduite que par Radix, le thymol et l’hélénaline. Les concentrations d’IL-4, d’IL-6, d’IL-9 et d’IL-17F étaient inférieures à la limite de quantification.
La carte de la voie de signalisation du TCR de KEGG présentée dans [ ] illustre les éléments qui relient le déclenchement du récepteur des lymphocytes T aux fonctions effectrices de ces cellules, à savoir leur prolifération, leur différenciation et la production de diverses cytokines telles que l’IL-2, l’IL-5, l’IL-10, l’IFN-γ et le TNF-α. Une analyse d’enrichissement de jeux de gènes (GSEA) a révélé que la voie de signalisation du TCR de KEGG (hsa04660) est ciblée de manière différentielle par les extraits d’arnica. Alors que le traitement par l’extrait Tota ou Radix a donné un score d’enrichissement normalisé (NES) négatif, l’extrait Ferm a, de manière surprenante, présenté un NES positif par rapport au témoin solvant. Comme Tota et Radix, l’hélénaline et le thymol ont donné un NES négatif. Ces résultats, conjointement à la réduction de l’expression des gènes de cytokines et à celle des concentrations de cytokines dans le surnageant, étayent l’hypothèse selon laquelle la voie de signalisation du TCR constitue une cible moléculaire des extraits d’arnica, du thymol et de l’hélénaline dans les PBT humains.
La translocation nucléaire de NFκB est inhibée par le thymol, mais pas par les extraits d’arnica
Au sein du réseau complexe de signalisation du TCR, la famille de facteurs de transcription NFκB est l’un des principaux régulateurs de l’expression d’IL2. Afin d’élucider davantage les mécanismes moléculaires à l’origine de la diminution de la production d’IL-2 après traitement par les extraits d’arnica, leur effet sur différentes étapes de la voie de signalisation de NFκB a été évalué. Dans les cellules non stimulées, NFκB, constitué des sous-unités p65 et p50, est lié à son inhibiteur IκB et localisé dans le cytoplasme. NFκB doit se déplacer vers le noyau pour devenir transcriptionnellement actif. La costimulation CD3xCD28 des lymphocytes T entraîne la phosphorylation et la dégradation de l’inhibiteur IκB. NFκB est ainsi libéré et peut ensuite pénétrer dans le noyau grâce à sa séquence de localisation nucléaire. L’analyse de la translocation nucléaire de NFκB par cytométrie en flux d’imagerie après costimulation CD3xCD28 des PBT a révélé que les extraits Ferm, Tota et Radix n’avaient pas d’influence significative sur le pourcentage de cellules contenant du NFκB nucléaire. Contrairement aux extraits d’arnica, le composé pur thymol et l’inhibiteur de la kinase IκB TPCA1 (10 μM), utilisé comme témoin positif, ont significativement réduit la translocation nucléaire de NFκB. Un effet cytotoxique du traitement par TPCA1 a été exclu par marquage au 7-AAD. L’hélénaline a eu tendance à inhiber la translocation nucléaire de NFκB.
[ ]
L’extrait d’arnica Radix inhibe spécifiquement la liaison de NFκB à l’ADN
Dans le noyau, NFκB se lie à son élément de réponse dans l’ADN, situé dans la région promotrice des gènes cibles, afin d’initier leur expression. La capacité de NFκB à se lier à l’ADN dans les lysats nucléaires de PBT traités avec le produit testé ou le véhicule a été évaluée au moyen d’un test fondé sur un ELISA. À cette fin, des puits revêtus d’une séquence consensus d’ADN double brin (ADNdb) ont été incubés avec le lysat nucléaire ; le NFκB lié à l’ADN a été marqué avec des anticorps, puis une lecture colorimétrique a été effectuée. Fait intéressant, seul l’extrait Radix a significativement réduit la liaison de NFκB (p65) à l’ADN. Bien que les extraits Ferm et Tota aient inhibé la production d’IL-2 dans une mesure similaire, ils n’ont réduit la liaison de NFκB à l’ADN que sous forme de tendance. En accord avec ces données, le thymol (principalement présent dans Radix) a également réduit la quantité de NFκB liée à l’ADN, tandis que l’hélénaline (principalement présente dans les parties aériennes de la plante) n’a exercé qu’un faible effet.
Outre sa liaison à l’ADN, NFκB doit être activé sur le plan transcriptionnel pour induire la transcription du gène de l’IL-2. L’activité transcriptionnelle de l’hétérodimère NFκB p65/p50 est régulée par différents sites de phosphorylation au sein de la sous-unité p65. Il a été décrit que la phosphorylation en Ser529 favorise l’activité transcriptionnelle. La phosphorylation de la sous-unité p65 en Ser529 a donc été analysée par cytométrie en flux et utilisée comme mesure pour déterminer si les extraits d’arnica affectent la voie NFκB à ce niveau de régulation. Cependant, aucun des extraits n’a significativement influencé le pourcentage de PBT phospho-NFκB+. Seul le thymol a significativement interféré avec la phosphorylation de NFκB (p65) en Ser529, tandis que le traitement par l’hélénaline n’a exercé aucun effet.
L’extrait d’arnica (Tota) Ferm réduit l’expression génique dépendante de NFAT par un mécanisme indépendant de l’influx calcique
Outre NFκB, la famille de facteurs de transcription NFAT joue un rôle crucial dans le contrôle de l’expression d’IL2. Comme NFκB, NFAT est retenu dans le cytoplasme des lymphocytes T non stimulés. Lors de l’activation, il est déphosphorylé et pénètre dans le noyau afin d’initier la transcription des gènes cibles. Pour étudier l’expression génique dépendante de NFAT et l’effet des extraits d’arnica, un test rapporteur de luciférase a été réalisé. La transfection des PBT s’étant révélée difficile, la lignée de leucémie T Jurkat a été utilisée pour ce test. Un effet cytotoxique des produits testés sur ce type cellulaire avait préalablement été exclu. L’activité de la luciférase de luciole, mesurée par luminescence comme indicateur de l’expression génique dépendante de NFAT, a été significativement diminuée par le traitement avec l’extrait Ferm. Le traitement par l’extrait Tota a entraîné une légère réduction, qui n’a pas atteint le seuil de significativité statistique. Pour l’extrait Radix, un effet sur l’expression génique dépendante de NFAT a pu être exclu, ce qui souligne son action spécifique sur la signalisation NFκB.
[ ]
L’activation de NFAT par déphosphorylation est assurée par l’activation, dépendante du calcium, de la sérine phosphatase calcineurine. L’influx de Ca2+ induit par la stimulation est donc l’un des facteurs qui régulent l’activation de NFAT. Pour étudier l’effet des extraits d’arnica sur les concentrations intracellulaires de Ca2+, les PBT ont été stimulés par réticulation du TCR-CD3 et l’influx de Ca2+ a été mesuré à l’aide du capteur de Ca2+ Indo-1. Comme prévu, l’engagement du TCR a nettement augmenté les concentrations intracellulaires de Ca2+. Aucun des extraits n’ayant exercé d’influence significative sur l’influx de Ca2+ par rapport au témoin solvant, Arnica Ferm a manifestement diminué l’expression génique dépendante de NFAT par un mécanisme indépendant du calcium, ou du moins situé en aval de l’élévation du Ca2+. Fait intéressant, conformément aux observations faites dans d’autres types cellulaires, le thymol a même augmenté le Ca2+ dans les PBT au repos. Toutefois, il a significativement diminué l’influx de Ca2+ dans les PBT stimulés par CD3xCD28 et réduit l’expression génique dépendante de NFAT. En revanche, l’hélénaline n’a exercé aucun effet sur ces deux paramètres.
Discussion
Arnica montana L. (arnica) est traditionnellement appliquée pour inhiber l’inflammation et favoriser la guérison de traumatismes fermés tels que les contusions ou les ecchymoses. Les lymphocytes T CD4+ jouent un rôle important dans le processus normal de cicatrisation musculaire en réponse à un traumatisme. Toutefois, la persistance de lymphocytes T CD4+ et CD8+ activés entraîne une inflammation durable et un retard de la réparation musculaire. Dans cette étude, nous avons évalué la capacité immunomodulatrice d’extraits d’arnica sur des lymphocytes T humains primaires afin de permettre une évaluation critique du mode d’action de l’arnica à partir de données expérimentales consolidées. Notre démarche consistant à comparer côte à côte trois extraits fabriqués différemment permet de mieux comprendre comment, par exemple, la partie de la plante ou le solvant d’extraction utilisés influencent leurs effets cellulaires.
Dans notre étude, nous avons utilisé de préférence des PBT humains primaires activés par des anticorps anti-CD3/CD28, ce qui reproduit la situation physiologique, à savoir la costimulation des lymphocytes T par des CPA professionnelles. Bien que l’utilisation de lignées cellulaires telles que les cellules de leucémie T Jurkat ou la lignée murine de macrophages J774 présente des avantages techniques, notamment leur disponibilité et leur facilité de manipulation, les résultats obtenus exclusivement sur des lignées cellulaires ne peuvent pas être directement transposés aux cellules primaires en raison de différences possibles, par exemple dans la transduction intracellulaire du signal. Avec le système expérimental décrit ci-dessus, un effet inhibiteur de tous les extraits d’arnica testés sur l’expression en surface de CD25 et sur la prolifération des lymphocytes T a été mis en évidence, ce qui n’avait jamais été décrit auparavant. Le traitement par l’arnica a également inhibé la production du facteur de croissance IL-2. Toutefois, le manque d’IL-2 n’est pas seul responsable de la diminution du taux de division cellulaire, car l’ajout d’IL-2 n’a pas pu rétablir une prolifération normale. En conclusion, l’effet inhibiteur de l’arnica sur la prolifération des lymphocytes T peut s’expliquer par l’association d’une diminution de la production d’IL-2 et d’une baisse de l’affinité de l’IL-2R résultant de l’expression réduite de la chaîne IL-2Rα (CD25). Outre l’IL-2, les PBT traités par l’arnica ont notamment libéré moins d’IL-10, d’IFN-γ et de TNF-α. Une diminution de la production de TNF-α après traitement par une teinture de fleurs d’arnica a également été observée dans des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), qui comprennent des lymphocytes et des monocytes, stimulées par du LPS. De même, en présence d’un extrait hydroalcoolique d’arnica provenant de la plante entière, la lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 a produit moins de TNF-α en réponse à une stimulation par du LPS et de l’IFN-γ.
Conformément à l’altération de la production de cytokines et de la division cellulaire dans les PBT, l’analyse de l’expression génique par nCounter®, suivie d’une analyse d’enrichissement de jeux de gènes, a révélé que les préparations d’arnica interviennent dans les cascades de transduction du signal du TCR. La transcription d’IL2 et d’autres gènes de cytokines après activation des lymphocytes T est contrôlée par plusieurs familles de facteurs de transcription, dont NFκB et NFAT. Fait intéressant, bien que les trois extraits d’arnica aient tous inhibé la production d’IL-2 dans une mesure similaire, ils ont affecté différemment les voies de signalisation des lymphocytes T conduisant à l’expression de l’IL-2. L’extrait hydroéthanolique de racine (Radix) a sélectivement inhibé la liaison de NFκB à l’ADN, tandis que l’extrait aqueux fermenté (Ferm), pour lequel la plante entière fraîche et fleurie a été utilisée, a principalement supprimé l’expression génique dépendante de NFAT. L’extrait hydroéthanolique de plante entière (Tota) a exercé un effet modéré sur les deux voies, sans toutefois atteindre le seuil de significativité statistique. Un effet sur la liaison de NFAT à l’ADN avait déjà été décrit pour des teintures d’arnica contenant principalement des lactones sesquiterpéniques. NFAT était alors complètement inhibé à de plus faibles concentrations. Cela laisse penser que l’effet sur NFAT décrit ici pourrait être imputable aux dérivés de l’hélénaline et de la dihydrohélénaline détectés dans l’extrait aqueux fermenté et, en plus faibles quantités, dans l’extrait hydroéthanolique de plante entière. Klaas et al. ont en outre montré que l’estérification des lactones sesquiterpéniques joue un rôle important dans leur activité. Cela pourrait expliquer pourquoi, dans la présente étude, le composé pur hélénaline n’a exercé aucun effet sur l’expression génique dépendante de NFAT.
[ ]
En accord avec les résultats relatifs à la liaison de NFκB à l’ADN, Röhrl et al. ont récemment décrit qu’un extrait hydroéthanolique d’arnica provenant de la plante entière inhibait l’expression d’un rapporteur NFκB dans des cellules de leucémie T Jurkat stimulées par un ionophore calcique et du PMA. En revanche, un effet inhibiteur sur la translocation nucléaire de NFκB, tel que celui décrit dans la lignée murine de macrophages J774 stimulée par du LPS et traitée par un extrait méthanolique de plante entière, n’a pas été détecté dans notre système expérimental utilisant des lymphocytes T humains primaires costimulés par CD3xCD28 et traités par l’extrait hydroéthanolique de plante entière (Tota). Plusieurs facteurs, dont les différences de type cellulaire utilisé (lignée de macrophages contre PBT primaires), de conditions de stimulation (LPS contre stimulation anti-CD3/CD28) et de solvant d’extraction de la plante (méthanol contre éthanol à 62 %), pourraient expliquer cette divergence.
Il importe de souligner que l’extrait Radix, préparé à partir de racines séchées par extraction hydroéthanolique, a spécifiquement interféré avec la liaison de NFκB à l’ADN et a efficacement inhibé l’activation et la prolifération des lymphocytes T. Conformément à ces résultats, le thymol, principalement présent dans Radix, a lui aussi diminué la liaison de NFκB à l’ADN, tandis que l’inhibition par l’hélénaline était moins marquée. Ces observations étaient particulièrement intéressantes puisque, jusqu’à présent, le potentiel immunomodulateur d’extraits purs de racine d’arnica n’avait pas été systématiquement étudié. Cela est probablement lié à l’absence présumée de LS bioactives, qui sont spécifiquement enrichies dans les capitules. Les futures études sur l’arnica ne devraient donc plus se limiter aux extraits de fleurs ou de plante entière, et les parties de la plante présentes dans le matériel testé, avec leur composition spécifique, devraient être clairement distinguées.
Comme les extraits d’arnica, le thymol et l’hélénaline ont également diminué l’expression de CD25, la production d’IL-2 et la prolifération des PBT. Jusqu’à présent, l’effet du thymol sur l’activation de lymphocytes T humains primaires isolés n’avait pas été étudié. Une réduction de la prolifération après traitement par le thymol n’avait été rapportée que pour les lymphocytes totaux du sang périphérique (PBL) et les cellules de leucémie T Jurkat. Dans une autre étude portant sur des cellules de leucémie T Jurkat, le traitement par le thymol a également réduit la production d’IL-2. Nos résultats montrent que le thymol a inhibé la translocation nucléaire de NFκB, la liaison de NFκB à l’ADN et la phosphorylation de la sous-unité p65 de NFκB en S529 dans les PBT. Le thymol a aussi interféré avec la signalisation calcique et l’expression génique dépendante de NFAT. Une diminution de la translocation nucléaire de NFAT2 a été observée dans des cellules de leucémie T Jurkat traitées par le thymol, ce qui étaye notre constat selon lequel le thymol diminue l’expression génique dépendante de NFAT. Des données divergentes ont été décrites concernant la phosphorylation de la sous-unité p65 de NFκB. Alors que le thymol a diminué la phosphorylation en S529 dans les PBT (notre présente étude), Gholijani et al. n’ont observé aucune influence significative dans les cellules Jurkat, sans toutefois préciser le site de phosphorylation. Les différences entre les PBT humains non transformés et les cellules leucémiques Jurkat transformées, les différences potentielles de site de phosphorylation analysé et l’utilisation d’extraits nucléaires pour le Western blot (Gholijani et al.), contre une analyse de la cellule entière par cytométrie en flux (présente étude), nuisent donc à la comparaison directe. Dans des cellules murines de macrophages RAW264.7 stimulées par du LPS, le thymol s’est révélé anti-inflammatoire, notamment en inhibant la phosphorylation de la sous-unité p65 de NFκB médiée par TLR4. Bien que ces données concordent avec les résultats décrits pour la phosphorylation en S529 de NFκB p65 dans les PBT de la présente étude, là encore, une comparaison directe n’est pas possible en raison de l’absence d’information sur le site de phosphorylation précis étudié par Wu et al.
Bien que des études menées sur des cellules non immunitaires aient déjà montré que le traitement par le thymol induit un influx calcique spontané, cet effet n’avait pas encore été décrit dans des lymphocytes T primaires. L’inhibition de l’influx calcique induit par la stimulation dans des PBT humains primaires (notre présente étude) apporte également de nouvelles informations sur le mécanisme moléculaire sous-jacent aux effets du thymol. Une inhibition de la mobilisation du calcium par le thymol avait déjà été observée dans des neutrophiles stimulés par la N-formyl-méthionyl-leucyl-phénylalanine (fMLP). En raison de sa nature hydrophobe, le thymol peut facilement traverser les membranes cellulaires et il a été constaté qu’il agit sur divers canaux ioniques, dont des membres de la famille des canaux calciques TRP. L’influence différentielle du thymol sur l’influx calcique dans les lymphocytes T primaires au repos et activés est une observation nouvelle et intrigante. Le mécanisme moléculaire sous-jacent reste toutefois à élucider. Il est concevable que le thymol puisse interférer avec l’entrée du calcium dans les lymphocytes T en agissant sur les canaux calciques activés par la vidange des stocks, tels qu’ORAI1, ou en modifiant la fluidité membranaire et, indirectement, la fonction des canaux. De futures études seront nécessaires pour clarifier ces mécanismes potentiels.
L’hélénaline a inhibé l’expression de CD25, la production d’IL-2 et la prolifération des PBT humains. En accord avec ces données, Berges et al. ont constaté que l’hélénaline inhibait l’expression de CD25, la production d’IL-2 et la prolifération des PBT CD4+. Toutefois, ces résultats ne peuvent pas être directement comparés, car Berges et al. se sont concentrés sur l’action proapoptotique de l’hélénaline et ont travaillé avec une concentration du produit qui, du moins entre nos mains, était toxique. En conséquence, dans notre étude, aucun effet de l’hélénaline sur l’expression génique dépendante de NFAT n’a été observé dans les PBT. À l’inverse, Berges et al. ont constaté une diminution significative de la translocation nucléaire de NFAT1 dans les PBT CD4+ en réponse à l’hélénaline. Là encore, cette observation pourrait être liée à l’utilisation d’une concentration cytotoxique du produit, alors qu’une concentration plus faible et assurément non toxique a été utilisée dans notre présente étude.
L’hélénaline a eu tendance à inhiber la translocation nucléaire de NFκB dans les PBT humains et a entraîné une inhibition faible mais significative de la liaison de NFκB à l’ADN. Il convient de noter que l’utilisation d’extraits nucléaires de cellules traitées ou non par l’hélénaline dans notre test de liaison à l’ADN ne permettait pas de déterminer si la quantité plus faible de NFκB lié à l’ADN résultait uniquement d’une réduction de la capacité de liaison à l’ADN ou, en outre, d’une légère altération de la translocation nucléaire. De futures études utilisant des techniques telles que les tests de retard sur gel (EMSA) ou des méthodes fondées sur l’imagerie pourraient contribuer à résoudre cette question et à clarifier davantage le mécanisme de modulation de NFκB. Dans les cellules Jurkat, Lyss et al. ont décrit que l’hélénaline alkyle sélectivement les groupes sulfhydryle des cystéines de la sous-unité p65 et inhibe ainsi la liaison de NFκB à l’ADN. Nos résultats concordent donc avec ceux de Lyss et al., bien que les concentrations d’hélénaline aient été beaucoup plus élevées dans leur étude (10–20 µM).
Des interactions synergiques ou antagonistes entre les composés présents dans les mélanges complexes pourraient contribuer à ces effets différentiels. Comme on pouvait s’y attendre et conformément aux différences observées dans le mode d’action moléculaire, la caractérisation phytochimique des extraits par LC-MS/MS et leur identification provisoire ont révélé des compositions entièrement différentes entre les extraits testés. Sans surprise, le thymol était préférentiellement présent dans Radix, tandis que l’hélénaline se trouvait principalement dans les extraits de plante entière. D’importantes différences phytochimiques entre des extraits préparés à partir de la plante entière fraîche et séchée ont également été décrites par Duthen et al. Notre identification provisoire des composés phytochimiques à partir de la littérature a révélé que les acides caféoylquiniques constituent le groupe de substances le plus abondant dans Tota et Radix. Nous avons donc poursuivi en testant dans notre système l’acide caféoylquinique pur, mono-, di- et tri-, afin de déterminer si ces substances pouvaient reproduire les effets des extraits d’arnica sur l’activation des lymphocytes T. Cependant, bien que les acides caféoylquiniques comptent parmi les constituants les plus abondants des extraits d’arnica, ils n’ont pas reproduit, dans nos tests, les effets immunosuppresseurs observés avec les extraits complets. Cela suggère que ces composés sont soit inactifs dans le contexte testé, soit susceptibles de nécessiter une transformation métabolique, des modifications de leur absorption cellulaire ou des interactions synergiques avec d’autres composants des extraits pour devenir fonctionnellement actifs. L’élucidation de ces possibilités nécessitera des études supplémentaires axées sur la stabilité des composés, leur biodisponibilité et les effets synergiques potentiels au sein des extraits végétaux. Bien que la présente étude ne dissèque pas toutes les interactions possibles, notre analyse des différents composés apporte quelques indications sur leurs contributions spécifiques.
En résumé, cette étude élucide les effets immunomodulateurs distincts de trois extraits d’arnica produits différemment sur des lymphocytes T humains primaires. En particulier, l’extrait de racine (Radix) a sélectivement inhibé la liaison de NFκB à l’ADN, tandis que l’extrait fermenté de fleurs entières (Ferm) a supprimé la transcription génique dépendante de NFAT (résumé dans [ ]). Ces résultats soulignent le potentiel des extraits d’arnica comme agents anti-inflammatoires ciblant différentes voies de signalisation des lymphocytes T. Compte tenu de leur modulation sélective de facteurs de transcription clés, ces extraits pourraient offrir des voies thérapeutiques innovantes pour traiter des affections inflammatoires induites par les lymphocytes T, telles que le psoriasis et l’arthrite. Les recherches futures devraient porter sur leurs effets sur différentes sous-populations de lymphocytes T associées aux maladies et recourir à des modèles in vivo afin de mieux préciser leur efficacité thérapeutique — potentiellement différente — dans les maladies inflammatoires chroniques. La compréhension de leur mode d’action moléculaire facilitera également l’évaluation des bénéfices et risques potentiels de l’association des différents extraits d’arnica à des médicaments conventionnels, tels que la ciclosporine A ou le FK506, qui inhibent eux aussi la signalisation de NFAT.
Dans le contexte du retard de réparation musculaire, associé à un excès d’inflammation et à la présence prolongée de lymphocytes T CD4+ et CD8+, l’inhibition de l’activité des lymphocytes T par l’arnica peut effectivement contribuer à interrompre l’inflammation et à rétablir le processus normal de cicatrisation musculaire. Cette idée est en outre étayée par des données indiquant que le thymol favorise la différenciation des lymphocytes T vers des lymphocytes T régulateurs immunosuppresseurs (Treg). Il faut toutefois veiller à intervenir au bon moment. Les lymphocytes T CD4+, en particulier, participent à la création initiale d’un milieu pro-inflammatoire qui constitue une composante essentielle du processus normal de guérison. Par conséquent, interférer trop tôt avec l’activité des lymphocytes T pourrait en réalité nuire à la réparation des tissus plutôt que la favoriser, tandis qu’un traitement plus tardif pourrait contribuer à résorber une activité inflammatoire excessive et à prévenir l’inflammation chronique. Globalement, une compréhension détaillée de l’implication spatio-temporelle des différents types de cellules immunitaires dans la cicatrisation musculaire et l’inflammation chronique serait souhaitable, afin de permettre une intervention thérapeutique fondée sur une connaissance précise des mécanismes cellulaires et moléculaires que l’arnica doit cibler aux différents stades du processus de guérison.
Bien que nos résultats mettent en évidence le potentiel immunomodulateur des extraits d’arnica in vitro, l’absence de données in vivo constitue une limite de la présente étude. Des modèles animaux d’inflammation cutanée médiée par les lymphocytes T, telle qu’une dermatite de type psoriasis, ainsi que des modèles d’altération de la régénération musculaire après une lésion, conviendraient pour évaluer précisément le potentiel immunomodulateur et régénérateur tissulaire des extraits d’arnica, compte tenu notamment de leur usage traditionnel dans les affections musculosquelettiques. De telles études in vivo seront essentielles pour évaluer la fenêtre thérapeutique optimale et la réversibilité des effets de l’arnica, afin d’orienter leur future transposition clinique.