Activité antioxydante de différents extraits d’écorce d’aulne noir (Alnus glutinosa) avec une alternative d’extraction plus verte
Référence : Plants (Basel) 2021. — PMID 34834894 · DOI 10.3390/plants10112531 Type : etude in vitro · Plante : Aulne glutineux · Propriété → Antioxydant Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Les composés phénoliques isolés de la biomasse végétale constituent des composants bioactifs présentant un large éventail de bénéfices pour l’humain, notamment des effets antioxydants, antimicrobiens ou anti-inflammatoires. Cet article présente la valeur potentielle de l’écorce d’aulne noir (Alnus glutinosa (L.) Gaertn. (Betulaceae)) pour la production de substances biologiquement actives, malgré son utilisation actuelle comme source de combustible de faible valeur. La plupart des méthodes d’extraction emploient des solvants organiques purs pour obtenir des extraits à haut potentiel antioxydant à partir de la biomasse. Le but de ce travail est de montrer les avantages et les inconvénients du procédé d’extraction en prenant en compte les principes de la « chimie verte » et en remplaçant les solvants organiques par le solvant « vert » qu’est l’eau. En tirant parti des avantages de l’extraction par solvant accélérée (ASE), il a été montré que l’utilisation d’eau déionisée offre la perspective de remplacer les solvants organiques. Dans le cas de l’extraction à l’eau en une seule étape, la teneur totale en polyphénols (TPC) varie de 0,55 à 0,62 équivalent acide gallique (GAE) g/g dans les extraits, selon la température, tandis qu’avec le résultat de l’extraction séquentielle avec les solvants organiques, la teneur en TPC des extraits à l’éthanol 40 % (v:v) va de 0,39 à 0,61 GAE g/g, selon la température. L’influence de la teneur totale en polyphénols et de la teneur totale en proanthocyanidines sur l’activité antioxydante est montrée. L’activité antioxydante (IC₅₀, mg/L) des extraits obtenus avec les solvants organiques dans le test au (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle) DPPH• varie de 4,05 à 9,58, selon la température dans la plage de 70–150 °C, respectivement, tandis que les résultats obtenus avec l’eau déionisée ont montré des résultats prometteurs dans la plage de 6,33–7,36 dans la plage de température de 70–150 °C, respectivement. L’extraction avec l’eau déionisée a montré qu’environ 90 % des substances des extraits obtenus avec les solvants organiques par extraction séquentielle peuvent être obtenues sous forme d’extraits à l’eau déionisée.
1. Introduction
Le genre Alnus, également connu sous le nom d’aulne, appartenant à la famille du bouleau (Betulaceae), est une espèce d’arbre qui pousse dans tout l’hémisphère nord et qui n’est pas particulièrement exigeante quant aux conditions de croissance. En moyenne, l’écorce, en tant que déchet forestier, représente jusqu’à 12 % de la biomasse totale à base de bois. L’écorce est unique, avec une composition chimique très différente selon divers facteurs tels que l’espèce d’arbre, les régions de croissance, les conditions du sol, l’impact environnemental, etc. La composition chimique est principalement constituée d’extractibles du bois. Chaque espèce d’arbre est caractérisée par une classe unique de composés ; par exemple, les chênes sont caractérisés par une teneur élevée en tanins, tandis que les aulnes sont caractérisés par les diarylheptanoïdes et les tanins, le pin par le stilbène, les terpénoïdes et d’autres composés, etc. Tous ces composés sont des métabolites secondaires végétaux.
Les parties des arbres, en particulier l’écorce, contiennent un large éventail de métabolites secondaires végétaux, qui sont de riches sources de composés bioactifs aux effets bénéfiques pour la santé. L’écorce d’aulne noir est utilisée depuis longtemps dans le monde entier en médecine populaire en raison de ses effets positifs sur la santé humaine. L’écorce d’aulne noir contient divers types de métabolites secondaires végétaux, notamment des terpénoïdes, des flavonoïdes, des diarylheptanoïdes, des phénols, des stéroïdes, des tanins et bien d’autres. L’écorce d’aulne noir est abondante en diarylheptanoïdes contenant le squelette 1,7-diphénylheptane. Les diarylheptanoïdes sont les principaux composants efficaces du genre Alnus pour leurs activités biologiques remarquables. Les composés phénoliques et les flavonoïdes, largement présents comme métabolites secondaires dans les plantes Alnus, sont importants en raison de leur capacité à agir comme antioxydants. Les antioxydants d’origine biologique ont été définis comme « des composés qui protègent les systèmes biologiques contre les effets potentiellement nocifs des processus ou réactions qui provoquent des oxydations extensives ». De même, les composés biologiquement actifs issus de la nature sont de plus en plus utilisés aujourd’hui pour assurer une protection sanitaire primaire. En outre, ces produits naturels servent de base à l’invention et à la production de nouveaux produits pharmaceutiques. Les antioxydants synthétiques comme le BHT (hydroxytoluène butylé), le TBHQ (tert-butylhydroquinone) et d’autres sont largement utilisés dans le monde en raison des facteurs mentionnés ci-dessus. Ils sont également beaucoup moins chers et chimiquement résistants, mais ces dernières années, des chercheurs ont montré les effets mutagènes et cancérigènes de ces antioxydants synthétiques pour la santé humaine, et il est donc nécessaire de chercher des alternatives pour remplacer les antioxydants synthétiques par des antioxydants naturels dérivés de matières premières d’origine végétale. L’utilisation de substances naturelles ne fournit pas toujours les effets nécessaires car la teneur en composant actif requis est faible ; il est donc nécessaire de trouver les moyens optimaux de séparer et de concentrer les composés biologiquement actifs et d’étendre leur utilisation. Une voie est l’extraction des substances naturelles, mais généralement les méthodes d’extraction classiques sont chronophages, énergivores et utilisent des solvants toxiques ; il est donc nécessaire de trouver des solutions nouvelles et efficaces pour séparer les extraits biologiquement actifs de manières plus sûres, moins coûteuses et plus respectueuses de l’environnement. L’extraction des composés naturels à partir de la biomasse végétale dépend de plusieurs facteurs, tels que la technique d’extraction, les matières premières et les solvants d’extraction utilisés. L’une des approches possibles repose sur le concept de la bioraffinerie et les principes de base de la chimie « verte », où toutes les parties de la matière biomasse sont utilisées efficacement sans aucune perte ni produits secondaires inutiles. Sur la base de cette approche, il est vital de développer de nouveaux procédés d’extraction qui permettent la réduction de la consommation d’énergie, l’utilisation de solvants alternatifs, l’utilisation de ressources renouvelables comme matières premières et, surtout, permettent l’obtention d’extraits purs, de haute qualité et hautement biologiquement actifs. Ce travail se concentre sur l’optimisation des procédés d’extraction en modifiant les principaux paramètres d’extraction, en utilisant des solvants verts alternatifs (l’eau) pour remplacer les solvants organiques. L’objectif principal de ce développement de procédé d’extraction est d’obtenir des extraits de haute qualité avec des techniques vertes et de les caractériser, en déterminant la teneur totale en polyphénols (TPC) et en proanthocyanidines (PAC) dans les extraits, qui sont principalement responsables de l’activité biologique des extraits, de caractériser l’activité antioxydante de ces extraits et de trouver les corrélations entre ces paramètres.
2. Résultats et discussion
La première étape du développement de la méthode d’extraction a été l’optimisation de chacune des variables de condition. Ainsi, le temps d’un cycle statique dans l’extraction séquentielle avec des solvants organiques de polarité croissante a été modifié de 3 à 7 min (trois cycles statiques à 90 °C), comme le montre la Figure 1A [ ]. Comme montré, l’utilisation de 5 min comme temps de cycle statique est optimale pour les procédés d’extraction par rapport à 7 min, où le rendement d’extraction n’est pas significativement plus élevé, car il faut aussi tenir compte de la non-homogénéité de la biomasse, qui peut légèrement altérer le rendement d’extraction. Après avoir déterminé le meilleur temps de cycle statique (5 min), le nombre de cycles statiques a été étudié à 90 °C, en variant ainsi de un à sept pour déterminer les conditions optimales (Figure 1B [ ]). Le nombre optimal de cycles statiques a été sélectionné à trois, puisque, en comparaison avec cinq et sept cycles, les rendements obtenus n’augmentaient pas assez fortement pour l’emporter sur la consommation accrue de ressources énergétiques.
L’augmentation significative des rendements d’extraits dans les résultats de sept cycles statiques répétés par rapport à ceux de trois et cinq cycles n’a pas été établie. Par conséquent, les régimes d’extraction à trois cycles statiques ont été choisis pour réaliser les expériences d’extraction suivantes en utilisant les solvants d’extraction sélectionnés. Dans la recherche ultérieure du procédé d’extraction avec des solvants organiques de polarité croissante, l’eau déionisée et l’eau à différents pH, avec extraction en une seule étape et séquentielle, la température d’extraction a été modifiée de 20 °C, de 70 °C à 150 °C (voir Figure 2A [ ]).
Comme le montre la Figure 2A [ ], en augmentant la température de 70 °C à 150 °C, le rendement total des extractibles augmente de 24 à 34 % o.d.w. Sur la base de ces résultats, les paramètres optimaux pour l’extraction à l’eau ont été sélectionnés : trois cycles statiques, un temps de cycle de 5 min avec une extraction en une seule étape à des températures croissantes. La température d’extraction a été modifiée de 20 °C, de 70 à 150 °C (Figure 2B [ ]). Comme montré, la même tendance peut être observée en utilisant une extraction en une seule étape avec de l’eau déionisée, comme dans le cas de l’extraction de l’écorce d’aulne noir avec des solvants organiques, et en augmentant la température de 70 °C à 150 °C, le rendement des extractibles augmente de 19 % à 29 %. Une extraction séquentielle avec de l’eau déionisée dans une plage de température de 70 °C à 150 °C (Figure 2B [ ]) montre que le rendement le plus élevé des extractibles est directement obtenu par la première extraction à une température de 70 °C, représentant un rendement de 22 % de l’écorce sèche. Jusqu’à une température de 110 °C, le rendement des extractibles diminue, mais à une température supérieure à 130 °C, le rendement des extractibles commence à croître légèrement, ce qui pourrait s’expliquer par la dégradation et la solubilisation subséquente des principaux composants macromoléculaires de la biomasse, tels que l’hémicellulose ou les fragments de lignine, dans les extraits. Klarić, M., et al. ont montré que le rendement de l’extrait aqueux pendant la procédure de macération n’est que de 4,3 %, tandis qu’avec l’extraction par solvant accélérée à 90 °C, une moyenne de 23 % de l’extrait a été obtenue. La méthode d’extraction par solvant accélérée dans ce travail montre l’avantage de pouvoir obtenir des composés biologiquement actifs à partir d’autres matières végétales d’origines différentes selon le même principe, car, par exemple, avec d’autres méthodes d’extraction classiques comme l’extraction Soxhlet, il n’est pas possible de travailler avec des mélanges de solvants, mais l’éthanol 40 % (v:v) est utilisé dans ce travail. Il faut aussi mentionner que l’extraction est réalisée au-delà du point d’ébullition des solvants utilisés, ce qui n’est pas non plus possible avec des méthodes d’extraction classiques comme l’extraction Soxhlet, l’extraction par lot (Batch), etc.
Pour obtenir les conditions optimales de l’extraction par solvant accélérée, et en prenant en compte le rendement d’extrait séparé, la teneur totale en phénols (TPC) dans l’extrait et la consommation d’énergie spécifique (Wh/g), l’approche de la méthodologie des surfaces de réponse a été utilisée (voir Figure 3 [ ]). Les équations obtenues ont été utilisées pour produire les tracés de surface montrant le rendement d’extrait et la teneur en TPC dans les extraits séparés, y compris la dépendance aux conditions d’extraction telles que la température, le nombre de cycles statiques et la durée du cycle statique.
L’optimisation du procédé donne le rendement d’extraction maximal et la teneur en TPC dans ces extraits, tandis que la consommation d’énergie spécifique minimale peut être atteinte avec une condition de procédé où la température est de 93 °C, le nombre de cycles statiques est fixé à trois et la durée d’un cycle statique est fixée à 5,3 min. De telles conditions ont également été utilisées dans les expériences ultérieures.
Pour s’assurer que l’eau était un solvant approprié comparable aux solvants organiques pour obtenir des phytochimiques de valeur à partir de l’écorce d’aulne noir, les extractions ont été réalisées avec des eaux de diverses origines. L’eau du robinet a été sélectionnée, ainsi que des eaux dont l’acidité a été modifiée pendant le processus d’électrolyse avec différents pH, ainsi que de l’eau à laquelle du carbonate de sodium a été ajouté pour la rendre alcaline. Après l’extraction, le rendement des extraits, les polyphénols totaux (TPC), les proanthocyanidines totales (PAC) et l’activité antioxydante (DPPH•) ont été déterminés (voir Tableau 1 [ ]).
En évaluant les résultats obtenus selon les données du Tableau 1 [ ], on peut voir que les résultats obtenus avec différentes eaux sont proches. L’analyse statistique a été réalisée en effectuant le test de Kruskal–Wallis (n = 4). Pour tous les paramètres, les valeurs p étaient > 0,05, indiquant l’absence de différence statistique significative entre les systèmes de solvant utilisés. Quant à l’extrait à l’eau déionisée, bien que le rendement d’extraction soit très proche de celui de l’eau du robinet, il faut tenir compte du fait que pour l’eau du robinet, les composés inorganiques sous forme de sels et d’oxydes augmentent le rendement d’extraction. Il en va de même pour les eaux électrolytiques et l’eau alcaline additionnée de carbonate de sodium. Ces composés inorganiques de l’eau utilisée entrant dans l’extrait pourraient potentiellement interférer avec l’utilisation ultérieure des extraits séparés. Par conséquent, pour la facilité d’utilisation, l’eau déionisée a été choisie pour les expériences ultérieures. En comparant les résultats avec les travaux d’autres auteurs, par exemple les extraits de chêne obtenus avec de l’eau, la TPC varie dans la plage de 0,3–0,4 GAE g/g, tandis que les extraits aqueux d’écorce d’aulne noir contiennent plus de TPC, 0,56–0,63 GAE g/g, et les valeurs obtenues d’activité antioxydante sont également élevées comparées aux extraits obtenus à partir des différentes plantes et de leurs différentes parties. L’extrait méthanolique de pistaches montre une TPC élevée de 0,56 GAE g/g avec une activité antioxydante relativement élevée, mais il faut noter qu’il est obtenu avec un agent d’extraction à solvant organique volatil qui n’est pas respectueux de l’environnement. Comme montré par Charu et al., à partir d’écorce d’aulne noir hongroise utilisant différents solvants, les auteurs ont obtenu des extraits avec des résultats bien plus faibles en termes de teneur totale en polyphénols, 21,25 et 15,14 GAE mg/g dans les extraits à l’éthanol-eau 80 % et à l’acétone-eau 80 %, respectivement. En comparant les résultats obtenus dans notre travail, qui sont en moyenne de 560 GAE mg/g et obtenus avec l’eau comme solvant, les résultats sont bien plus élevés. Des résultats similaires peuvent être observés dans la littérature, où des échantillons d’écorce d’aulne noir ont été collectés dans la région de Kaliningrad et extraits avec de l’eau, et les résultats sont en moyenne 10 fois plus faibles pour la TPC.
Après l’extraction avec l’eau déionisée, le résidu a été extrait séquentiellement avec des solvants organiques pour déterminer quelle quantité de composés solubles dans les solvants organiques sélectionnés pouvait être obtenue avec l’eau déionisée (voir Tableau 2 [ ]). L’extraction séquentielle avec les solvants organiques à 90 °C a été utilisée comme référence.
Comme on peut le voir dans le Tableau 2 [ ] avec le n-hexane, après l’extraction avec l’eau déionisée 1,77 ± 0,04 %, l’extrait au n-hexane est obtenu, et le calcul montre que seulement 27,80 ± 0,81 % des extraits lipophiles sont transférés dans l’eau déionisée, tandis que les extraits hydrophiles sont transférés presque complètement, avec des résultats de 85,68 ± 2,37 % et 91,60 ± 2,19 % pour les fractions éthanol et acétate d’éthyle, respectivement. Afin d’évaluer la viabilité des extraits obtenus en tant que composés phytochimiques de valeur, la teneur totale en polyphénols (TPC) a été déterminée pour les extraits et exprimée en GAE g/g. Les résultats de l’extraction par solvant accélérée de l’écorce d’aulne noir avec des solvants organiques — hexane, acétate d’éthyle (ETC) et éthanol 40 % (v:v) (ETH) — et la teneur en polyphénols varie selon le solvant utilisé et dépend fortement de la température (voir Figure 4 [ ]).
Comme on peut le voir, la teneur plus élevée en polyphénols dans tous les cas se trouve dans les extraits obtenus avec l’ETC comme solvant. À mesure que la température d’extraction augmente, la teneur en polyphénols dans les extraits ETH diminue ; en revanche, elle augmente dans les extraits ETC, ce qui peut s’expliquer par la dégradation des composés de haut poids moléculaire et la transition plus facile dans l’extraction ETC. L’extraction ETC a été réalisée avant l’extraction ETH. En recalculant la teneur en polyphénols par rapport à la biomasse d’écorce d’aulne noir, on peut voir qu’une température accrue réduit la teneur phénolique totale dans les extraits ETH mais l’augmente dans l’extrait ETC. La teneur totale cumulée en polyphénols des extraits séparés de l’écorce augmente jusqu’à une température de 110 °C, puis reste constante à mesure que la température est augmentée davantage. L’extraction de l’écorce avec l’eau déionisée à différentes températures, dans les extractions en une seule étape et séquentielles, indique que la teneur en polyphénols dans l’extraction en une seule étape, jusqu’à 110 °C, est presque constante et diminue légèrement avec l’augmentation de la température au-dessus de 110 °C (Figure 5 [ ]).
Pour l’extraction séquentielle avec l’eau déionisée, la teneur totale en polyphénols diminue drastiquement à mesure que le rendement des extractibles diminue (voir Figure 2B [ ]). Dans le cas de l’extraction séquentielle, cela s’explique par la transition des composés polyphénoliques dans le solvant pendant la première étape d’extraction. Cependant, dans le cas de l’extraction en une seule étape à une température supérieure à 110 °C, la teneur en polyphénols est réduite, mais pas très drastiquement, et cela pourrait s’expliquer par les processus physico-chimiques en cours dans la biomasse extractible, tels que la dégradation et la solubilisation subséquente de diverses macromolécules. En recalculant les résultats par rapport à la biomasse de départ, on peut voir que la teneur en polyphénols augmente avec l’extraction en une seule étape. On peut également conclure que la quantité de polyphénols présente dans les extraits obtenus dans le cas de l’extraction par solvant accélérée avec l’eau déionisée, calculée sur l’écorce, est comparable aux extraits obtenus avec les solvants organiques, et est en moyenne de 0,16 GAE g/g sur l’écorce. Les valeurs obtenues pour l’activité antioxydante sont comparées avec les paramètres prédéfinis, tels que la teneur totale en polyphénols, pour évaluer la corrélation entre eux. La Figure 6A [ ] montre une comparaison des valeurs du test de capacité d’absorption des radicaux oxygène (ORAC) pour les extraits d’écorce d’aulne noir obtenus avec les solvants organiques, et les valeurs ORAC sont plus élevées pour les extraits ETC (plus la valeur ORAC est élevée, plus l’antioxydant est puissant) que pour les extraits ETH, et ce rapport augmente avec l’augmentation de la température, comme dans la Figure 5 [ ] où le rapport de teneur en polyphénols augmente en raison de la température.
Une corrélation positive est observée pour les extraits ETC de l’écorce d’aulne noir entre des paramètres tels que le test ORAC et la teneur en polyphénols totaux GAE g/g (voir Figure 6B [ ]), et plus l’extrait contient d’activité antioxydante, plus les composés polyphénoliques totaux sont nombreux, et vice versa. La Figure 7A [ ] montre la corrélation entre la teneur totale en polyphénols et le test ABTS•⁺ de l’extrait ETC d’écorce d’aulne noir (dans le test ABTS•⁺, plus la valeur est faible, plus l’activité antioxydante est élevée). La Figure 7B [ ] montre la corrélation entre la teneur totale en polyphénols et le test DPPH• de l’extrait ETH d’écorce d’aulne noir. Dans les deux cas, une teneur en TPC plus élevée conduit à une activité antioxydante plus élevée.
Pour l’extraction séquentielle à l’eau de l’écorce d’aulne noir, il existe aussi une corrélation positive entre l’activité antioxydante dans les tests ORAC, ABTS•⁺ et DPPH• et la teneur totale en polyphénols dans les extraits. L’évaluation de la corrélation de l’activité antioxydante totale avec la teneur totale en polyphénols dans les extraits obtenus par extraction séquentielle avec des solvants organiques à différentes températures (Figure 8A [ ]), et avec l’eau déionisée en une étape et l’extraction séquentielle à différentes températures (Figure 8B [ ]), montre que toutes les valeurs des tests d’activité antioxydante sont similaires dans tous les tests, selon les paramètres d’extraction.
Les valeurs des coefficients de corrélation de Pearson calculées pour la relation entre l’activité antioxydante et la teneur phénolique totale étaient significativement supérieures aux valeurs critiques, qui sont égales à 0,532 et 0,638 pour l’extraction avec les solvants organiques (N = 14) et l’eau (N = 10), respectivement.
L’oxydation des lipides est la principale raison du développement du rancissement dans les aliments contenant des matières grasses, particulièrement lorsqu’ils sont riches en acides gras polyinsaturés. Par conséquent, la principale fonction des antioxydants est de prolonger la durée de conservation des aliments en retardant l’oxydation des lipides. Il est évident que l’ajout de 1,00–5,00 mg/g d’extrait à l’eau déionisée d’écorce d’aulne noir à la mayonnaise améliore significativement sa stabilité à l’oxydation de manière dose-dépendante. Par exemple, 1,00 et 5 mg/g de l’extrait ont augmenté la période d’induction d’oxydation (IP) de 2,32 h à 3,26 et 4,78 h, respectivement (Tableau 3 et Figure 9 [ ]).
Pendant l’extraction de l’écorce d’aulne noir avec l’eau déionisée à différentes températures, des mesures de consommation électrique ont été effectuées. Comme le montre la Figure 10 [ ], l’étape de plus grande consommation d’énergie va jusqu’à 400 s, ce qui s’explique par le chauffage du four d’extraction par solvant accélérée, qui consomme près de la moitié de la capacité énergétique, après quoi significativement moins d’énergie est consommée dans le procédé d’extraction.
Ces données ont été utilisées comme base pour calculer la consommation d’énergie pour produire une unité de l’extrait à des températures spécifiées (voir Tableau 4 [ ]). Le tableau montre que la consommation d’énergie par unité d’extrait ne change pas aux températures de 130 °C et 150 °C, mais jusqu’à 130 °C, elle augmente.
3. Matériels et méthodes
3.1. Matériel végétal
La matière première, l’écorce d’aulne noir (A. glutinosa), a été récoltée en mai 2019 sur des arbres âgés de 27 ans poussant dans la municipalité d’Ogre en Lettonie. Conditions de croissance : forêt de feuillus, sol humide et bonnes conditions de croissance. Après la collecte, l’écorce a été séchée à température ambiante jusqu’à ce que la teneur en humidité soit d’environ 10 %, puis a été broyée à l’aide d’un broyeur Retch AS100 (Retch GmbH, Haan, Allemagne) à 1500 tr/min avec un tamis de 2 mm. L’écorce broyée a été stockée dans un congélateur à −18 °C jusqu’à analyse ultérieure.
3.2. Produits chimiques et réactifs
Le n-hexane, l’acétate d’éthyle, le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH•), l’acide 2,2′-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS•⁺), le réactif de Folin–Ciocalteu, l’acide gallique, le méthanol, le dichlorhydrate de 2,2′-azobis(2-méthylpropionamidine) (AAPH), la fluorescéine et la solution saline tamponnée au phosphate pH = 7,4 (PBS) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne). Tous les produits chimiques utilisés pour les analyses étaient de qualité analytique, et toutes les solutions de test ont été fraîchement préparées avant utilisation.
3.3. Préparation des échantillons
L’écorce a été extraite avec des solvants sélectionnés (dans un rapport de 1:3,5 (écorce d’aulne noir:solvant)), eau déionisée, eau du robinet, eau du robinet après électrolyse à différents pH (pH = 2,57 et pH = 11,62), eau déionisée avec Na₂CO₃ et solvants organiques : n-hexane, acétate d’éthyle et éthanol:eau (40:60, v:v) dans différentes séquences : uniquement avec des solvants organiques en augmentant leur polarité, n-hexane→acétate d’éthyle→éthanol:eau selon la méthodologie précédemment développée décrite dans [ ] ;
Uniquement avec de l’eau déionisée : eau du robinet et eau à différents pH ;
Méthodes d’extraction combinées : avec de l’eau déionisée puis avec des solvants organiques séquentiellement.
En modifiant le temps de cycle statique d’extraction de 1–10 min à différentes températures (ambiante à 150 °C) et en modifiant le nombre de cycles statiques (1–7). Toutes les procédures d’extraction ont été réalisées au moins en triplicat. Après l’extraction, les solvants utilisés ont été évaporés sous vide (évaporateur rotatif, Heidolph Instruments) et lyophilisés (lyophilisateur, Heto PowerDry PL3000), et les extraits obtenus ont été stockés à −20 °C. Tous les résultats ont été exprimés sur une base de poids sec et sans cendres.
3.4. Teneur totale en polyphénols (TPC)
La teneur en polyphénols extractibles (TPC) dans les extraits obtenus a été déterminée par analyse de Folin–Ciocalteu. Une quantité de 1 mL de solution d’extractibles hydrophiles (dans de l’éthanol 50 % (v:v)) a été ajoutée à 0,5 mL du réactif phénol de Folin–Ciocalteu suivie d’une agitation douce. Après 5 min, 1 mL de carbonate de sodium à 20 % (p/v) a été ajouté. La solution a été immédiatement diluée jusqu’à 5 mL avec de l’eau distillée et mélangée soigneusement. Après 10 min, une densité optique à 765 nm du complexe bleu résultant a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre UV/VIS PerkinElmer Lambda 650 contre le blanc, en utilisant l’acide gallique comme étalon. Les teneurs phénoliques totales ont été exprimées en g d’équivalents d’acide gallique (GAE) par g d’échantillon d’extrait séché.
3.5. Activité antioxydante
L’activité antioxydante des extraits d’écorce d’aulne noir obtenus a été évaluée à l’aide du test avec des radicaux libres, DPPH• et ABTS•⁺, et mesurée par spectrophotométrie, où l’activité de piégeage des radicaux libres a été exprimée en IC₅₀ (la concentration requise pour 50 % d’inhibition du radical libre). Plus la valeur d’IC₅₀ est faible, plus l’activité antioxydante est élevée. Dans le test de piégeage du radical DPPH•, la méthode décrite ci-dessus a été adoptée avec des modifications mineures. Une solution d’échantillon dans le DMSO (0,03 mL) a été mélangée pendant 15 min avec 3,0 mL d’une solution de DPPH• 1 × 10⁻⁴ mol/L dans le méthanol, puis l’absorbance à 517 nm du mélange a été immédiatement mesurée à l’aide d’un spectromètre UV/VIS Perkin Elmer Lambda 625. L’ABTS•⁺ a été produit en faisant réagir le 2,2-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) (ABTS) avec du persulfate de potassium (K₂S₂O₈). L’absorbance à 734 nm a été lue à température ambiante après 10 min. La solution PBS a été mesurée comme échantillon à blanc.
Le test ORAC cinétique appliqué a caractérisé le potentiel antioxydant à prévenir l’oxydation de la fluorescéine. Les valeurs ORAC finales ont été calculées à l’aide d’une équation de régression (Y = aX + b) corrélant la concentration de Trolox (50–100 µM dans le PBS) et l’aire nette sous la courbe de décroissance de la fluorescéine. La capacité d’absorbance des radicaux des extraits a été exprimée dans ce test en équivalent Trolox (TE), le mmol par gramme d’échantillon antioxydant. La valeur TE plus élevée correspond à l’activité antioxydante plus élevée.
L’activité antioxydante des extraits à l’eau déionisée d’écorce d’aulne noir à deux concentrations vis-à-vis de l’oxydation des lipides en atmosphère d’oxygène a été déterminée dans une mayonnaise commerciale dans un appareil Oxipres (Mikrolab Aarhus, Danemark) fonctionnant à 120 °C. La période d’induction (IP, en heures) de l’oxydation a été lue au moment où la pression a commencé à diminuer brusquement. L’activité antioxydante des additifs a été évaluée par leurs facteurs de protection (PF) : PF = IPx/IPk (1) où IPx est l’IP d’oxydation avec additif et IPk est l’IP pour l’échantillon sans additif.
3.6. Teneur totale en proanthocyanidines
La méthode acide-butanol pour déterminer la teneur totale en proanthocyanidines dans les extraits a été réalisée comme décrit dans la littérature. Dans un tube à bouchon vissé ont été ajoutés 1 mL d’échantillon, 6 mL de réactif acide-butanol (950 mL de n-butanol avec 50 mL de HCl concentré) et 0,2 mL de solution de sulfate ferrique d’ammonium à 2 % dans 2 mol de HCl. Les échantillons ont été passés au vortex et incubés pendant 50 min dans un bain-marie à 90 °C. Ensuite, les échantillons ont été refroidis et l’absorbance a été mesurée à 550 nm. Les concentrations de proanthocyanidines ont été déterminées par la courbe d’étalonnage de l’étalon dimère B2 d’épicatéchine.
3.7. Mesures de la consommation d’énergie
La consommation totale d’énergie, dépendant de la valeur de température et de la durée d’extraction, a été mesurée à l’aide de l’indicateur de puissance électrique SENECA S604E-6-MOD (SENECA, Padoue, Italie). La consommation d’énergie spécifique a été calculée en tenant compte du poids sec des extraits isolés. Chaque expérience a été répétée trois fois et les données ont été moyennées.
3.8. Traitement statistique des résultats
Les valeurs mesurées sont présentées sous forme de moyenne avec un intervalle de confiance (à un niveau de signification α = 0,05). Chaque mesure a été effectuée au moins en triplicat. Les calculs statistiques ont été réalisés à l’aide de MS Excel et IBM SPSS Statistics 21.0 (Microsoft Corp, Redmond, WA, USA).
4. Conclusions
Par extraction séquentielle avec des solvants organiques, il est possible de diviser les composés extractibles de l’écorce d’aulne noir en groupes pour séparer les composés lipophiles avec le n-hexane, les composés semi-polaires avec l’acétate d’éthyle et les composés polaires avec l’éthanol. En comparant les extraits combinés obtenus avec les solvants organiques, un peu plus d’extractibles sont obtenus par rapport à l’extraction à l’eau en une étape ou séquentielle à différentes températures. À mesure que la température augmente, l’extraction séquentielle avec les solvants organiques et l’extraction en une seule étape avec l’eau déionisée augmentent les rendements des extractibles tandis que la teneur totale en polyphénols dans les extraits varie avec la température. Avec les solvants organiques, on peut observer que la TPC augmente dans les extraits à l’acétate d’éthyle mais diminue dans les extraits ETH avec l’augmentation de la température. La TPC augmente jusqu’à 110 °C avec l’extraction à l’eau puis commence à diminuer légèrement avec l’augmentation de la température, tandis que la TPC diminue dramatiquement avec les extractions séquentielles à l’eau, ce qui s’explique par le rendement d’extraction. En comparant les extraits obtenus par l’extraction séquentielle d’un solvant accéléré, les extraits avec des solvants organiques (somme d’ETC et ETH) et les extraits avec l’eau contiennent des quantités comparables de composés polyphénoliques converties en écorce brute et forment une moyenne de 0,16 GAE g/g, ce qui permet l’utilisation de l’eau comme solvant vert alternatif. Cependant, dans certains cas, la teneur totale en polyphénols des extraits individuels obtenus avec l’ETC est aussi élevée que 0,8 GAE g/g. L’extraction avec l’eau permet aussi d’obtenir des extraits avec une bonne activité antioxydante comparée aux solvants organiques, mais en évaluant les propriétés physicochimiques et les coûts des solvants, l’eau peut être utilisée comme alternative verte aux solvants organiques pour obtenir des extraits ayant un bon potentiel d’être des antioxydants naturels et donc de concurrencer de manière prospective dans de nombreux domaines les antioxydants synthétiques largement utilisés. Il a été montré qu’en introduisant les extraits obtenus dans le travail avec des méthodes de production plus vertes dans des systèmes alimentaires réels, il est possible d’augmenter leur stabilité par deux, et ainsi la haute valeur potentielle de ces extraits comme antioxydants a également été montrée.