Préparation d’une huile d’amande d’abricot (Prunus armeniaca L.) enrichie en micronutriments et évaluation de ses propriétés chimiopréventives in vitro
Référence : International Journal of Molecular Sciences 2025. — PMID 41009803 · DOI 10.3390/ijms26189237 Type : etude in vitro · Plante : Abricotier · Propriété → Cancer Accès : ⭐ libre (open access) → texte intégral traduit Fidélité : traduction intégrale et fidèle du texte des auteurs. Appels [n] omis ; figures/tableaux « [ ] ».
Résumé
Les amandes d’abricot (Prunus armeniaca L.) représentent un sous-produit précieux de la culture des fruits à noyau, offrant diverses applications dans les industries alimentaire, cosmétique et pharmaceutique. Bien que l’huile d’amande d’abricot soit reconnue pour sa composition riche en acides gras insaturés, composés phénoliques et tocophérols, son potentiel thérapeutique, en particulier dans la prévention du cancer, reste inexploré. Cette étude a examiné une fraction purifiée (FOPF) obtenue à partir de l’huile d’amande de la variété Farclo, cultivée dans la région d’Émilie-Romagne en Italie et sélectionnée pour sa teneur naturellement faible en amygdaline. Des études in vitro ont démontré les effets antiprolifératifs significatifs de la FOPF contre des lignées cellulaires de cancer colorectal (LoVo, HT29) et d’hépatocarcinome (Hep3B), avec des valeurs de GI50 (inhibition de croissance à 50 %) allant de 0,06 à 0,09 mg/mL. La fraction a induit un arrêt du cycle cellulaire et inhibé significativement la migration des cellules cancéreuses, effets médiés par la modulation de l’expression de PPAR-γ. Ces résultats établissent le potentiel de la FOPF comme agent chimiopréventif naturel et fournissent une base pour son développement en tant qu’ingrédient nutraceutique ciblant les cancers colorectaux et hépatiques.
1. Introduction
La culture de l’abricot (Prunus armeniaca L.) se classe au troisième rang économique parmi les fruits à noyau, appréciée pour sa forte concentration en micronutriments essentiels, importants pour la nutrition humaine. Ce fruit, riche en polyphénols, vitamines et caroténoïdes, peut être consommé frais, séché, ou transformé en jus et produits en conserve. Les amandes, également appelées amandes amères, sont couramment jetées et représentent des déchets lors de la transformation de l’abricot. Cela est dû à la présence du glycoside cyanogène amygdaline, responsable de l’amertume et d’effets secondaires potentiels, car son métabolisme in vivo produit du cyanure d’hydrogène (HCN). L’huile d’abricot est obtenue à partir des amandes. Constituée d’environ 50 % d’acides gras insaturés, de 23–27 % de teneur en protéines et de 32–34 % d’acides aminés essentiels, elle est enrichie en tocophérol total et possède une teneur élevée en minéraux, en particulier potassium et magnésium. Le rendement et la composition de l’huile présentent une variation importante, influencée par des facteurs tels que l’origine géographique, le cultivar d’abricot et la méthode d’extraction. La concentration en amygdaline varie également selon le cultivar, l’altitude du champ et l’état de maturation, et permet de classer les abricots comme sucrés (teneur en HCN entre 30,2 et 79,2 mg/100 g) et amers (teneur en HCN entre 220,55 et 317,7 mg/100 g). Un rôle crucial dans la définition de la composition de l’huile est également joué par la méthode d’extraction appliquée. Les extractions mécaniques ou chimiques conventionnelles de l’huile peuvent entraîner une dégradation thermique, une oxydation et des pertes d’huile. Les nouvelles méthodes d’extraction (extraction assistée par ultrasons ou micro-ondes, extraction par fluide supercritique et extraction assistée par enzymes) offrent plusieurs avantages, tels qu’une amélioration potentielle du rendement, la préservation de la qualité de l’huile et la promotion d’opérations respectueuses de l’environnement. Concernant la sécurité, la principale préoccupation avec les extraits d’amande d’abricot est la présence d’amygdaline, qui est métabolisée in vivo en cyanure d’hydrogène (HCN) et, à forte exposition, peut provoquer des effets indésirables sévères. En outre, les essais cliniques de laétrile/amygdaline ont historiquement échoué à démontrer des bénéfices thérapeutiques, tout en soulevant systématiquement des préoccupations concernant la toxicité liée au cyanure. Sur la base de ces preuves, toute application translationnelle doit soigneusement équilibrer l’efficacité potentielle et la sécurité, en particulier compte tenu du fait qu’une forte exposition peut entraîner des effets secondaires sévères, avec une dose létale rapportée de 0,5–3,5 mg/kg chez l’adulte. Pour atténuer ce risque, diverses méthodes de traitement peuvent être employées pour réduire la teneur en amygdaline de l’huile d’amande, dont le broyage et le trempage, ainsi que des approches plus avancées telles que la fermentation, le traitement enzymatique, les ultrasons ou le traitement par micro-ondes.
L’huile d’amande d’abricot est largement utilisée dans l’industrie cosmétique et fait aussi l’objet d’investigations pour des applications pharmaceutiques. Sa capacité à combattre le fardeau des infections microbiennes a été démontrée, agissant comme agent antibiofilm, capable d’inhiber la formation de biofilm et d’agir contre le biofilm mature de cinq pathogènes différents. D’autres bienfaits pour la santé associés à l’amande d’abricot sont des activités anti-inflammatoire et antioxydante. De plus, il a été mis en évidence que l’huile de graine d’abricot contient des métabolites aux propriétés chimiopréventives et antitumorales, en faisant un candidat prometteur à explorer comme ingrédient alimentaire fonctionnel. Par exemple, de bons résultats ont déjà été obtenus dans la chimioprévention du cancer du côlon et du carcinome épidermoïde de la langue après des essais cellulaires.
Cette étude caractérise l’huile d’amande de la variété Prunus armeniaca Farclo, à maturation tardive et à haut rendement, cultivée principalement dans le nord de l’Italie, se distinguant par sa faible teneur en amygdaline et ses propriétés organoleptiques supérieures. L’extrait purifié, enrichi en gamma-sitostérol, acide oléique et son dérivé l’ester 2,3-dihydroxypropylique de l’acide (Z)-9-octadécénoïque, présente un potentiel anticancéreux prometteur, ces composés ayant été montrés dans des études précédentes comme induisant un arrêt du cycle cellulaire, favorisant la réversion des cellules cancéreuses vers des phénotypes sains et exerçant une large activité anticancéreuse. Cette recherche examine en outre son potentiel en tant que nutraceutique chimiopréventif pour réduire le risque de cancer colorectal (CRC) et d’hépatocarcinome (HCC), deux tumeurs malignes souvent associées à des facteurs liés au mode de vie et au métabolisme.
2. Résultats
2.1. Purification de l’huile d’amande d’abricot
L’huile d’abricot fournie par la Società Agricola Guidi di Roncofreddo s.s. a été obtenue par pression à froid de graines issues de la campagne de production de 2018. La première étape du présent travail a consisté à évaluer la teneur en amygdaline de l’huile pour en apprécier la sécurité. Les résultats ont mis en évidence que la concentration du métabolite considéré était de 10 mg/kg d’huile, une valeur inférieure à celle obtenue avec d’autres cultivars, mais encore trop élevée pour être considérée comme sûre. En effet, en utilisant la même procédure d’extraction, la teneur en amygdaline peut atteindre 400 mg/kg d’huile, tandis que la concentration considérée comme sûre est inférieure à 5 mg/kg d’huile. Par conséquent, une purification supplémentaire de l’huile brute a été nécessaire pour développer un extrait au bon profil de sécurité. Pour atteindre cet objectif, la méthodologie de fractionnement sélectionnée a été l’extraction liquide-liquide chauffée par micro-ondes, ce chauffage étant capable d’augmenter le partage des métabolites pour de nombreux systèmes de solvants. Cette procédure a été menée pour atteindre deux objectifs distincts : abaisser à la fois la teneur en amygdaline et la fraction lipophile, réduisant ainsi la toxicité de l’extrait et améliorant sa manipulation. En détail, l’induction par micro-ondes peut provoquer la dégradation de l’amygdaline, réduisant drastiquement sa teneur. L’huile de graine d’abricot a ensuite été mise en suspension dans l’éthanol, et le système biphasique a été soumis à trois cycles de chauffage par micro-ondes. La phase éthanolique a été évaporée sous pression réduite. L’analyse de la fraction nouvellement obtenue a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse. Pour atteindre cet objectif, une analyse approfondie GC/(EI)MS (source 70 eV) équipée d’un analyseur simple quadripôle a été réalisée. Les jeux de données instrumentaux originaux ont été analysés avec deux logiciels différents : le NIST Mass Spectra Search Program (https://chemdata.nist.gov, version 2.4, consulté le 25 mars 2020) et AMDIS v 2.73. Pour la recherche en bibliothèque, nous avons utilisé une recherche en bibliothèque intégrée par NIST à l’aide de la bibliothèque 2020. La structure résultante proposée par ce logiciel avec une probabilité absolue nous a donné les structures des métabolites les plus abondants. En particulier, nous avons tracé non seulement l’abondance relative des substances sélectionnées, mais aussi le facteur de correspondance en bibliothèque. Les résultats ont mis en évidence la présence d’acide oléique (27 %), d’ester 2,3-dihydroxypropylique de l’acide (Z)-9-octadécénoïque (15 %), de gamma-sitostérol (32 %), doté de propriétés antidiabétiques et antihyperlipidémiques, de squalène (6 %), un triterpène connu pour ses propriétés antimicrobiennes et anticancéreuses, et de stigmasta-diène (4 %). En raison du pourcentage élevé de ces deux métabolites, la composition en micronutriments ne peut être déterminée. Par conséquent, la fraction obtenue a été redissoute dans le méthanol et extraite à nouveau trois fois avec de l’hexane. La fraction méthanolique a été évaporée sous pression réduite, fournissant un solide blanc, désormais appelé fraction purifiée Farclo (FOPF). La FOPF a été analysée à l’aide de la méthode GC/(EI)MS précédemment développée. Les résultats de cette analyse ont permis d’identifier les structures les plus probables, également en accord avec les voies métaboliques de la biomasse analysée (Figure 1). [ ]
Les résultats ont mis en évidence la présence d’acides gras résiduels, à savoir l’acide ricinoléique (1,06 %), l’acide oléique (16,72 %) et l’ester 2,3-dihydroxypropylique de l’acide (Z)-9-octadécénoïque (21,16 %). Les autres métabolites majeurs sont le saccharose (6,51 %), un dérivé de stilbène (6,22 %), le gamma-tocophérol (5,87 %) et le gamma-sitostérol (26,21 %). Les arrangements de doubles liaisons, pour le gamma-sitostérol en particulier, ont été déterminés par une analyse approfondie des fragments obtenus dans la source d’ions d’un instrument EI.
2.2. L’huile de graine d’abricot purifiée inhibe la croissance des cellules cancéreuses in vitro
Nous avons employé un panel de lignées cellulaires de cancer gastro-intestinal, comprenant deux lignées de cancer du côlon (LoVo et HT29) différant par leur capacité de réparation de l’ADN (le système MMR étant déficient dans LoVo), et la lignée de carcinome hépatocellulaire (HCC) Hep3B. Ces lignées cellulaires sont largement utilisées dans les tests de métabolisme des médicaments et de cytotoxicité. L’effet de la FOPF sur la croissance cellulaire a été déterminé après 72 h d’administration quotidienne répétée, aux concentrations de 0,001 mg/mL, 0,01 mg/mL et 0,1 mg/mL. Comme le montre la Figure 2A, la FOPF a montré un effet cytostatique significatif à la concentration maximale testée, induisant un arrêt de la croissance cellulaire dans toutes les lignées testées avec une inhibition de croissance de 50 % (GI50) allant de 0,06 mg/mL dans les cellules HT29 à 0,09 mg/mL dans les cellules Hep3B. L’arrêt de la croissance cellulaire, mis en évidence par microscopie, s’est également accompagné d’un détachement considérable de cellules viables de la surface du flacon, compatible avec une anoïkose (Figure 2B). [ ] En cohérence avec l’anoïkose, nous avons également détecté une diminution du niveau d’expression de PPAR-γ dans les lignées cellulaires testées après 72 h de traitement par la FOPF, comme trouvé précédemment (Figure 2C). En particulier, l’analyse de l’expression génique a montré que le niveau d’expression de PPAR-γ était significativement diminué par rapport aux cellules non traitées, à la fois dans les lignées Hep3B (p < 0,0001) et LoVo (p < 0,0001). Dans les cellules HT29 après traitement par la FOPF, l’expression de PPAR-γ n’est pas évaluable.
En outre, l’analyse par cytométrie en flux a démontré des altérations du cycle cellulaire compatibles avec l’inhibition de la croissance cellulaire dans toutes les lignées étudiées. Comme le montre la Figure 3A, les cellules LoVo et Hep3B traitées ont présenté une accumulation significative de cellules en phase G0–G1 par rapport aux cellules non traitées (augmentation de 5 % dans les cellules Hep3B et de 13 % dans les cellules LoVo). De plus, les cellules LoVo ont également montré une diminution significative (50 %) des cellules en phase S. Concernant les cellules Hep3B, elles ont aussi présenté une diminution de 25 % de la phase G2-M par rapport au témoin. À l’inverse, les cellules HT29 n’ont pas présenté d’accumulation significative de cellules similaire à celle observée dans les cellules LoVo et Hep3B. Cependant, après 72 h de traitement par la FOPF, une proportion significative (15 %) de population sub-G0/G1 a été observée, suggérant une induction de la mort cellulaire programmée. Ensuite, le test à l’annexine V/FITC a été réalisé dans les trois lignées cellulaires. Les résultats ont montré une absence d’apoptose et de nécrose dans les cellules LoVo et Hep3B traitées (Figure 3B), confirmant que la FOPF exerce uniquement un effet cytostatique mais aucune activité de destruction cellulaire dans ces deux lignées, comme il ressortait du test MTS. En outre, comme attendu d’après l’analyse du cycle cellulaire, des cellules apoptotiques ont été détectées à la fois en phase d’apoptose précoce (16 %) et tardive (10 %) dans la lignée cellulaire HT29.
2.3. L’huile de graine d’abricot purifiée entrave le taux de migration des cellules cancéreuses
Un test de cicatrisation (wound-healing) a été mené pour évaluer l’impact de la FOPF sur la capacité migratoire des cellules HT29 et LoVo, qui présentent toutes deux des degrés variables de potentiel métastatique hépatique. La FOPF a été utilisée aux concentrations de 0,001 mg/mL, 0,01 mg/mL et 0,1 mg/mL. Après 72 h d’exposition avec administration répétée, les cellules LoVo et HT29 ont perdu leur capacité à migrer. L’inhibition de la migration a été observée avec une concentration plus élevée dans les cellules LoVo (Figure 4A). Dans les cellules HT29, la concentration testée la plus élevée a déterminé un détachement complet des cellules et, pour cette raison, l’effet sur le blocage de l’invasion a été observé à une concentration plus faible de 0,01 mg/mL, comme le montre la Figure 4A. En particulier, dans les cellules LoVo traitées par la FOPF, le pourcentage de surface exempte de cellules, calculé à l’aide d’ImageJ (version 1.54f), était significativement plus élevé que dans les cellules non traitées (63 % contre 37,3 %, p < 0,009) dès 48 h (Figure 4B). Après 72 h d’exposition, la surface exempte de cellules était encore significativement plus élevée par rapport aux cellules témoins (49,6 % contre 2,55 %, p < 0,0001). Dans les cellules HT29, caractérisées par un taux de croissance plus faible que les cellules LoVo, la différence de surface de brèche entre cellules témoins et traitées n’était significative qu’après 72 h (58,7 % contre 40,4 %, p > 0,003).
3. Discussion
L’huile de graine d’abricot obtenue par pression à froid a été le point de départ du développement d’un nouvel ingrédient pharmaceutique à potentiel antitumoral. Les résultats préliminaires ont mis en évidence que la teneur en amygdaline de l’huile dépassait la limite généralement considérée comme sûre, de sorte qu’une purification supplémentaire était nécessaire pour en diminuer la concentration avant d’évaluer le potentiel anticancéreux in vitro. En détail, une fraction purifiée a été préparée en appliquant une extraction liquide/liquide assistée par micro-ondes à 60 °C. Les micro-ondes sont largement utilisées pour l’extraction de produits naturels, étant plus efficaces que les techniques d’extraction traditionnelles et apportant une série d’avantages : faible consommation de solvant, temps d’extraction courts et efficacité supérieure. Plus précisément, les micro-ondes sont également capables de réduire la teneur en amygdaline par dégradation. Deux extractions successives assistées par micro-ondes ont été réalisées, en utilisant huile/éthanol puis méthanol/hexane comme systèmes biphasiques. À la fin de la première partie du processus, la fraction se présentait sous forme d’huile. Sa composition était principalement caractérisée par la présence de gamma-sitostérol et d’acide oléique, qui représentaient collectivement plus de la moitié du phytocomplexe total, présentant un double défi. Tout d’abord, la forte lipophilie du mélange peut poser des problèmes dans les tests biologiques ultérieurs en raison d’une mauvaise solubilité, nécessitant l’utilisation d’un pourcentage élevé de diméthylsulfoxyde pour solubiliser. De plus, le pourcentage élevé de ces métabolites pourrait diluer l’effet des micronutriments présents dans la fraction. Pour ces raisons, nous avons réalisé une seconde extraction liquide/liquide, obtenant une fraction purifiée enrichie en micronutriments, nommée FOPF. Le processus d’extraction est résumé dans la Figure 5. [ ]
Son empreinte chromatographique a été établie par une analyse GC/(EI)MS. Cette méthodologie nous permet à la fois de discriminer entre différents chimiotypes et de réaliser une caractérisation rigoureuse d’une matrice complexe. Les résultats ont mis en évidence que les acides gras résiduels représentaient environ 39 % de la FOPF, tandis que les autres métabolites majeurs étaient le saccharose (6,51 %), un dérivé de stilbène (6,22 %), le γ-tocophérol (5,87 %) et le γ-sitostérol (26,21 %). Ces composés présentent un intérêt particulier, étant déjà associés à des activités liées à la prévention et au traitement du cancer. Le composé cyanogène résiduel présent dans la FOPF était le 2-méthyl-benzonitrile, bien qu’il ne constitue que 1,5 % de la fraction, ne représentant donc pas une menace sérieuse pour la sécurité. Les propriétés chimiopréventives de la FOPF ont fait l’objet d’une investigation biologique approfondie sur trois lignées cellulaires cancéreuses distinctes : LoVo (cancer colorectal), Hep3B (cancer du foie) et HT29 (adénocarcinome colorectal), largement utilisées dans les tests de métabolisme des médicaments et de cytotoxicité.
L’inhibition observée de la croissance cellulaire dans les trois lignées est supposée résulter d’une anoïkose induite, comme en témoignent des caractéristiques morphologiques telles qu’un phénotype flottant et une taille cellulaire réduite par rapport aux cellules témoins. En outre, la diminution significative des niveaux d’expression du gène PPAR-γ dans les trois lignées cellulaires traitées par la FOPF appuie encore l’hypothèse de l’anoïkose. L’effet était particulièrement prononcé dans les cellules HT29, où l’expression de PPAR-γ a été complètement abolie après le traitement, et dans les cellules Hep3B où elle a été réduite de 50 %. Ces caractéristiques biomoléculaires de l’anoïkose s’alignent sur les observations antérieures de Terasaki et al. dans les cellules de cancer colorectal humain DLD-1 traitées au fucoxanthinol et de Schafer et al. dans les cellules Hep3B utilisant des inhibiteurs de PPAR-γ. Cohérente avec cette preuve, la FOPF a induit des altérations substantielles du cycle cellulaire dans les trois lignées testées. Les cellules LoVo traitées ont présenté une réduction spectaculaire de leur réservoir de phase S, tandis que les cellules Hep3B traitées ont affiché un profil de cycle cellulaire altéré par rapport au témoin, avec une réduction significative de la phase G2-M. Les cellules HT29 traitées ont présenté une population significative de cellules en phase sub-G0–G1, suggérant une incapacité à progresser dans le cycle cellulaire et l’initiation de programmes apoptotiques. En cohérence avec les données de l’analyse du cycle cellulaire, les tests à l’annexine/FITC V sur les cellules HT29 ont révélé une apoptose significative induite par la FOPF. De plus, les anomalies observées du cycle cellulaire dans les trois lignées pourraient être révélatrices d’un cadre général où les cellules traitées restent viables mais deviennent métaboliquement inactives, conduisant à l’effet cytostatique induit par la FOPF. Cette condition a été reflétée par l’activité anti-migration pertinente évaluée par le test de cicatrisation dans les cellules LoVo et HT29. Cette inhibition de la migration est cruciale pour la prévention des métastases, car elle entrave la capacité des cellules à se propager et proliférer dans des sites distants. Dans ce travail, nous avons démontré les propriétés chimiopréventives de la FOPF. Dans cette fraction, la présence de composés associés à une activité cytotoxique sur les lignées cellulaires cancéreuses a été identifiée. Par exemple, il a récemment été démontré que l’acide ricinoléique est actif contre les lignées HT29 et Hep3B. Des effets antitumoraux similaires ont été observés avec le γ-tocophérol dans des modèles tumoraux in vitro et in vivo et avec le γ-sitostérol, tous deux présents à des niveaux élevés dans notre FOPF. Des résultats similaires ont été obtenus avec le gamma-tocophérol. D’autres études visant à définir le potentiel cytotoxique de chaque métabolite et leur mécanisme d’action seront présentées en temps voulu.
4. Matériel et méthodes
4.1. Matériel
Les solvants et additifs ont été achetés auprès de Sigma–Aldrich (Burlington, MA, États-Unis). L’huile de graine d’abricot Farclo a été obtenue par pression à froid de graines issues de la campagne de production de 2018 par la Società Agricola Guidi (Roncofreddo, Italie). Elle a été conservée à l’obscurité à −20 °C jusqu’à l’extraction.
4.2. Instruments
MARSX press, CEM Corporation, Matthews, NC, États-Unis. Système GC/MS Thermo ISQ (ISQ-MS couplé à un GC Thermo Trace 1300/1310 avec un dispositif d’échantillonnage automatique). Spectromètre de masse Thermo Scientific (Milan, Italie), système ISQ Single Quad utilisant le Trace GC comme dispositif chromatographique (Milan, Italie). Instrument Heidolph Laborota 4000 (Heidolph Instruments GmbH & Co., Schwabach, Allemagne).
4.3. Extraction et fractionnement
Cinq mL d’huile brute ont été additionnés de cinq mL d’éthanol et soumis à un chauffage par micro-ondes (montée en 1 min, temps de maintien de 5 min, pression maximale 250 psi, puissance maximale 80 W, température 60 °C). Cette procédure a été répétée trois fois en renouvelant le solvant, obtenant 313 mg d’extrait éthanolique (Farclò EtOH), qui a été fractionné plus avant par extraction liquide/liquide (méthanol/hexane). La fraction méthanolique a été évaporée sous pression réduite, fournissant un solide blanc, une fraction purifiée Farclo (FOPF) (9 mg). La fraction hexanique a également été évaporée, fournissant une huile (297 mg).
4.4. Chromatographie en phase gazeuse
Colonne : Restek Rxi : 30 m, 0,25 mm de diamètre interne, 0,25 mm d’épaisseur interne.
Conditions opératoires : gaz vecteur = He, T-inj = 280 °C, T-ligne de transfert = 300 °C, source d’ions = 350 °C. Débit du vecteur = 1,0 mL/min, injection avec dispositif d’injection split/splitless avec un rapport de split de 40:1. Volume d’injection = 1 mL. Le régime sera le suivant : 60 °C (1 min), 10 °C/min (300 °C), et 300 °C (10 min).
Analyse des jeux de données instrumentaux originaux : NIST Mass Spectra Search Program 1f (version 2.4, build 25 mars 2020) et AMDIS v 2.73 (version du 25 avril 2017), build 149.31.
4.5. Expériences in vitro
4.5.1. Culture des lignées cellulaires
Les lignées cellulaires d’adénocarcinome du côlon (LoVo et HT29) et la lignée de HCC (Hep3B) ont été obtenues auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, États-Unis). Les lignées cellulaires ont été maintenues en monocouche à 37 °C et 5 % de CO2. Les cellules LoVo et Hep3B ont été cultivées respectivement dans du milieu Ham’s F-12K (Kaighn’s) (ATCC®) supplémenté de 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) (Euroclone®, Milan, Italie) et de l’EMEM (ATCC®) avec 10 % de SVF. Les cellules HT29 ont été cultivées dans du Roswell Park Memorial Institute RPMI (Euroclone®, Milan, Italie) supplémenté de 10 % de SVF. Pour le traitement par la FOPF, les milieux cellulaires ont été supplémentés de 1 % de pénicilline-streptomycine (Gibco®, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) et de 2 % d’amphotéricine B (Euroclone®, Milan, Italie).
4.5.2. Test de croissance cellulaire
La croissance cellulaire a été déterminée avec le CellTiter96AQueous One Solution (Promega®, Milan, Italie). Les cellules LoVo, HT29 et Hep3B ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité de 2 500 cellules par puits. Vingt-quatre heures après l’ensemencement, les cellules ont été traitées avec un milieu contenant la FOPF à 0,001 mg/mL, 0,01 mg/mL et 0,1 mg/mL. Toutes les 24 h, le milieu de culture a été remplacé par un milieu frais contenant les mêmes concentrations de FOPF. Ce processus a été répété pendant 72 h, suivant un schéma d’administration quotidienne. L’absorbance de la plaque à 96 puits a été analysée avec un lecteur de microplaques BioTek Synergy™ H1 à 24, 48 et 72 h à 490 nm. Toutes les expériences ont été réalisées en triplicat. L’inhibition de croissance et l’effet cytocide de la FOPF ont été calculés selon la formule de Monk : [(DO traitée − DO zéro)/(DO témoin − DO zéro)] × 100, lorsque la DO traitée est ≥ à la DO zéro. Si la DO traitée est inférieure à la DO zéro, une destruction cellulaire a eu lieu, tandis qu’une inhibition de la croissance cellulaire a lieu si la DO traitée est inférieure à la DO témoin mais supérieure à la DO zéro. La DO zéro représente le nombre de cellules au moment de l’ajout de la FOPF, la DO témoin reflète le nombre de cellules dans les puits non traités, et la DO traitée reflète le nombre de cellules dans les puits traités le jour du test.
4.5.3. Test de cicatrisation (wound-healing)
Les cellules ont été ensemencées dans une culture-insert à deux puits en μ-Dish (Ibidi®, Gräfelfing, Allemagne) à une densité de 5,0 × 10⁵ par puits. Après 24 h, l’insert a été retiré et le milieu remplacé par un milieu frais contenant la FOPF (0,001 mg/mL, 0,01 mg/mL et 0,1 mg/mL). Ce protocole a été répété les 2 jours suivants (48 h et 72 h). La tendance de migration cellulaire a été suivie à 0, 24, 48 et 72 h après le traitement au microscope EVOS et calculée en analysant la surface exempte de cellules, à l’aide de l’outil de mesure de cicatrisation du logiciel ImageJ. Toutes les expériences ont été réalisées en triplicat.
4.5.4. Annexine V/FITC
Les cellules ont été ensemencées dans des flacons de 25 cm² à une densité appropriée. Vingt-quatre heures après l’ensemencement, les cellules ont été traitées avec la FOPF 0,1 mg/mL. Après 24 h, le milieu cellulaire a été remplacé par un milieu frais contenant la FOPF 0,1 mg/mL. Toutes les 24 h, le milieu de culture a été remplacé par un milieu frais contenant les mêmes concentrations de FOPF. Après 72 h à partir du premier traitement, les cellules ont été détachées et traitées avec le kit annexine V/FITC de Thermo Fisher (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) et lues avec un cytofluoromètre Attune NXT® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Toutes les expériences ont été réalisées au moins en quadruplicat.
4.5.5. Analyse du cycle cellulaire
Les cellules ont été ensemencées dans des flacons de 25 cm² à une densité appropriée. Vingt-quatre heures après l’ensemencement, les cellules ont été traitées avec la FOPF 0,1 mg/mL. Après 24 h, le milieu cellulaire a été remplacé par un milieu frais contenant la FOPF 0,1 mg/mL et le même traitement a été réalisé après 24 h, atteignant le schéma d’administration quotidienne. Après 72 h à partir du premier traitement, les cellules ont été détachées, fixées à l’éthanol à 70 % et conservées à −20 °C pendant au moins 24 h. Après la fixation, les cellules ont été rincées dans du PBS et colorées dans une solution contenant du NP40, de la RNase et de l’iodure de propidium (IP). L’analyse du cycle cellulaire a été évaluée par cytométrie en flux (Attune NXT®). Toutes les expériences ont été réalisées au moins en triplicat.
4.5.6. qRT-PCR
Les cellules ont été ensemencées dans un flacon de 25 cm² à une densité de 210 000 cellules. Vingt-quatre heures après l’ensemencement, le milieu a été remplacé par un milieu frais contenant la FOPF 0,2 mg/mL. Après 72 h de traitement, les cellules ont été détachées et conservées dans du Trizol®. Après extraction et quantification de l’ARN par Nanodrop™, la rétrotranscription a été réalisée à l’aide du kit de synthèse d’ADNc iScript™. L’expression de PPAR-γ a été mesurée par RT-PCR en utilisant HPRT et GAPDH comme gènes de référence, à l’aide de l’appareil 7500 Applied Biosystem® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Toutes les expériences ont été réalisées au moins en triplicat.
4.6. Analyse statistique
Les données quantifiables ont été dérivées d’au moins trois expériences indépendantes et exprimées en pourcentage moyen relatif au témoin non exposé ± erreur standard de la moyenne (SEM). L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du logiciel GraphPad Prism 8 en appliquant le test t de Student pour les comparaisons entre deux groupes.
5. Conclusions
Cette étude présente la FOPF, une nouvelle fraction purifiée issue de l’huile d’amande d’abricot Farclo, caractérisée par des concentrations significatives de composés bioactifs, dont l’acide ricinoléique et le gamma-tocophérol. Notre investigation a démontré le potentiel anticancéreux de la FOPF par de multiples mécanismes : effets cytostatiques sur différentes lignées cellulaires cancéreuses (LoVo, HT29 et Hep3B), inhibition significative de la migration des cellules cancéreuses et modulation du cycle cellulaire. Les effets observés semblent médiés par l’inhibition de l’expression de PPAR-γ, suggérant une voie moléculaire spécifique pour l’activité anticancéreuse de la FOPF. D’un intérêt particulier est l’impact différentiel de la FOPF sur diverses lignées cellulaires cancéreuses, montrant à la fois des effets cytostatiques et une induction de l’apoptose selon le contexte cellulaire. La capacité de la FOPF à inhiber la croissance des lignées cellulaires de cancer colorectal et de HCC, combinée à son origine naturelle et à sa composition chimique définie, la positionne comme un candidat prometteur pour le développement nutraceutique. Bien que ces résultats in vitro soient encourageants, les recherches futures devraient se concentrer sur des études in vivo pour valider le potentiel chimiopréventif de la FOPF et établir des schémas posologiques optimaux. En outre, les investigations sur les contributions individuelles des métabolites constitutifs de la FOPF seront cruciales pour comprendre son mécanisme d’action.
Ces résultats posent les bases du développement d’un complément alimentaire ciblé pour les personnes à haut risque de carcinome colorectal ou de HCC, en particulier celles ayant des antécédents de ces cancers. Une telle approche préventive pourrait représenter une avancée significative dans les stratégies de chimioprévention du cancer, offrant une option naturelle et potentiellement efficace pour la réduction du risque de cancer.